关于Exo的WB检测
急问,做Exo的WB检测前,Exo沉淀到底是该有RIPA裂解还是直接用PBS重悬?以前制备的Exo都是用PBS重悬的,600ng/ul左右,如果再加RIPA,是否蛋白浓度太低,能否直接加loading buffer煮沸,再超声,就上样跑胶?谢谢!可以用PBS先洗一下,然后再加RIPA裂解,一般沉淀不会轻易被洗掉 谢谢楼上诸位,直接加4xloading buffer 95度10min,冻回-80度,明天上样跑WB 上样20ug,WB曝光,效果不理想,CD9,TSG101,GRP94, abcam兔源单抗,1/1000,二抗1/5000,其中TSG101(曝光120s)很弱,GRP94总蛋白(曝光120s)出现条带,但EXO也有弱带,难道标准差异超离所得产物不纯?而CD9完全无带,直接孵鼠源抗CD81过夜(未stripe),明天再看。 如果效果还不理想,就准备最多上50ug,另外改用RIPA重悬pellet,提高抗体浓度,或改用胶片曝光,目前只能够想到这些,请大家多建议,谢谢 Johnny 发表于 2015-4-3 03:34
你离心的步骤具体是怎么样的?
CD9没有条带应该是正常的,感觉不是所有的细胞分泌的exosome都有CD9。
按照wiley protocol来的,CD9关键是提取的细胞总蛋白也没有曝光出来。
谢谢! 我们的也没有出来 luckkit 发表于 2015-4-3 12:44
上样20ug,WB曝光,效果不理想,CD9,TSG101,GRP94, abcam兔源单抗,1/1000,二抗1/5000,其中TSG101(曝光120 ...
弱弱问下,你提EXO做WB,统一上样量后,岂不是所含exo量相同,那exo上的标志蛋白的量不就也相同了,刚接触,求解答,我想做WB表明exo的量。
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本帖最后由 luckkit 于 2015-5-7 13:56 编辑不同组织或细胞来源的Exo其标志蛋白含量不尽相同,WB似乎不能用于Exo定量,用NTA系统吧 WB的意义是什么呢?
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