cherry 发表于 2016-7-11 10:41:00

外泌体提RNA浓度很低，qPCR循环数35左右，曲线良好，但觉...

如题，像大家所反映的外泌体RNA浓度低，大概20~ 50ng/μL ，A260/A280 1.2~1.7左右，做过好几次，但每次qPCR 循环数都30以上，老师说量太少，A260/280低说明不纯，反转录cDNA量不一致，不能说明问题，大家有什么更好的解决方案么？最近尝试加大上清量试一试。欢迎交流~

hzangs 发表于 2016-7-11 10:52:22

用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以不做参考，Qiagen的kit抽提的RNA 这个值也在1.6附近。
一般 GAPDH的CT值可以跑到20左右甚至更低

grapetian 发表于 2016-7-11 19:31:10

hzangs 发表于 2016-7-11 10:52
用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以 ...

你好 我想问你们是用什么提rna?我想提细胞培养上清外泌体的rna用哪个试剂盒比较好？还是直接提exosome后加trizol提取？我看sbi和qiagen的都是提血清或血浆的外泌体rna

hzangs 发表于 2016-7-11 20:36:24

grapetian 发表于 2016-7-11 19:31
你好 我想问你们是用什么提rna?我想提细胞培养上清外泌体的rna用哪个试剂盒比较好？还是直接提exosome后 ...

我用trizol{:3_60:}

cherry 发表于 2016-7-13 11:09:35

grapetian 发表于 2016-7-11 19:31
你好 我想问你们是用什么提rna?我想提细胞培养上清外泌体的rna用哪个试剂盒比较好？还是直接提exosome后 ...

天根的比较好，101bio 提外泌体RNA 的产量是100μL 外泌体 RNA 产量50~100ng,远远不够，其他试剂盒我不知道，我觉得不需要试剂盒，天根比较彻底。

cherry 发表于 2016-7-13 11:13:33

hzangs 发表于 2016-7-11 10:52
用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以 ...

恩，我这次上清液250ml试一下，还有我用的U6为内参，逆转录试剂盒是bio-rad 的，SYBR GREEN 是赛默飞的，这些性能好么？

hzangs 发表于 2016-7-13 14:16:09

cherry 发表于 2016-7-13 11:13
恩，我这次上清液250ml试一下，还有我用的U6为内参，逆转录试剂盒是bio-rad 的，SYBR GREEN 是赛默飞的， ...

没有用过这些，不太了解。 应该还可以

完颜云裳 发表于 2016-8-10 23:36:27

楼主后面加大上清量结果有改善吗？我跑的结果也是这样，关键是U6也到了30几个循环了:L:L:L

cherry 发表于 2016-8-12 17:58:43

完颜云裳 发表于 2016-8-10 23:36
楼主后面加大上清量结果有改善吗？我跑的结果也是这样，关键是U6也到了30几个循环了 ...

加大上清有改善，真的，因为我们样本量太小了，能养多少细胞别客气，尽量养，多收上清，他们上清用得比较少做出来是因为有一些是分泌型细胞，我的是一般肿瘤细胞，这次是100ml 收的U6 循环数22左右

完颜云裳 发表于 2016-8-16 23:19:40

感谢楼主的分享,我们做的是病人血清,一管500ul。这样一来结果就能解释了。
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