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标题: exosome-free FBS的制备策略及使用技巧 [打印本页]
作者: hzangs 时间: 2016-7-26 16:35
标题: exosome-free FBS的制备策略及使用技巧
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exosome-free FBS的制备策略及使用技巧
最近坛子里有几位朋友询问exosome-freeFBS的制备方法，hzangs在每个帖子都做了回答。为了方便大家了解这方面的技巧，hzangs在这里做一个略微的总结并提供一份简要的protocol给大家参考。面对诸多大牛，可能我的叙述有不严谨的地方，班门弄斧还请各位多多指正。
很多朋友目前都在尝试从细胞培养上清中分离外泌体，这就存在一个问题：使用正常培液养细胞再换无血清培液收外泌体，还是直接使用exosome-free FBS配制培液用于培养细胞收外泌体？hzangs打开自己endnote里的文献集，从上自下打开数篇CNS及子刊的paper，参考了一下（PMID：24735924、25417103、25985394、26524530、26106858），所有的这些CNS及子刊的paper均是使用exosome-free FBS培养细胞再收上清分离exosomes的。由此可见，在高质量的paper里，大家更倾向于使用含有exosome-free FBS培液来培养细胞收上清分离exosomes。至少肿瘤研究方面是这样的！[attach]876[/attach]
既然很多高质量的paper都在使用exosome-freeFBS配制的培液培养细胞收外泌体。作为追风者的我虽然没有能力发这些高质量的paper，但是单位里还是有设备让我在方法上接近高质量paper的。自我安慰一下，哈哈！ [attach]877[/attach]
废话这么多，那就开始分享一下一些paper里提到过的使用超速离心机制备exosome-free FBS的方法吧。目前常见的有两种方法，一种是先配置20%FBS的培液，然后培液超速离心去除exosomes后用于细胞培养，另一种是直接FBS长时间超速离心去除exosomes后再用于配制培液养细胞。考虑到工作量以及机器的使用频率，hzangs选择了后者，当然这也是很多paper里选择的方法。下面我就来分享一下大概的制备流程。至于分离效果，我们在最后秀数据讨论。如何使用这些exosome-free FBS 我们也在后面说。
材料及设备：FBS、超速离心机、超速离心机转子、50ml离心管、0.45um滤器、10ml或20ml注射器。
1、 你需要将FBS融化成液体，这是必须的。[attach]878[/attach]
2、 之后你需要将FBS分装到超速离心管中，上机超离120000g 14-16h。PS:一般hzangs会在这一步选择过夜超离，因为晚上使用超速离心机的人很少很少，这样既不会耽误别人的实验，也节省自己的时间。
3、 你需要收集离心管里约90%的上清。注意，这里不要倒，一定要使用移液器从上方吸出来。最好用十几毫升的那种pipette，方便省时还易操作。你需要贴着液面吸取FBS，以避免扰动底部的沉淀，请参见下图：
[attach]879[/attach]
（PS：大家有没有被hzangs的绘画功底所折服，反正我自己已经被折服了，大家就凑合看吧。 哈哈哈哈哈哈）
4、 转移到50ml离心管的FBS混匀后使用0.45um的滤器过滤即可得到无菌的exosome-free 的FBS。冻起来，随用随取。
每次制备会有10%的血清损耗，这是不是太浪费了！！！
[attach]880[/attach]
先别急着扔。这部分血清还有其他用处。你可以收起来备用。依据hzangs的师弟实践得出真知，这部分血清可以用于冻存细胞，或者有哪些细胞状态不好，可以用这部分血清配制培液养一养，细胞会长得生龙活虎，明显比一般的FBS培养的细胞涨势迅猛！
可能还有朋友比较担心，这样制备的exosome-free FBS是否会残留大量的exosomes。我们可以参考一下beckman所提供的数据。
这个数据上可以看出，超离后的FBS含有的粒子数目明显低于普通FBS，与商品化的exosome-free FBS相近。
[attach]881[/attach]
培养细胞收上清很麻烦。该如何操作比较简便呢？
hzangs分享一下自己的方法给大家作参考。以培养肿瘤细胞为例。通常会先铺50%密度的细胞到培养皿中，然后加入exosome-free FBS配制的培液，培养72小时。hzangs的细胞刚好是72h从50%长到100%，之后吸取上清用于外泌体分离，细胞消化下来继续按照50%的密度铺板，继续使用exosomes-free FBS配制的培液培养，72h后就又可以收一次了。
Hzangs的分享到此结束。有实验条件的朋友可以尝试一下。如有其它问题，大家可以到坛子里的同名贴下留言给我。谢谢大家~
作者: stones 时间: 2016-7-26 22:51
画风清奇，有B站之风。。这贴纯干货啊。
作者: hzangs 时间: 2016-7-26 22:53
谢谢~~
作者: ashey 时间: 2016-7-27 09:20
首先，感谢楼主的干货分享！！！就需要这样的帖子！还想问楼主一个小问题，就是楼主超速离心时所用的离心机转子和离心管，之前买的离心管没盖子，做不到无菌。
作者: Aurorachen 时间: 2016-7-27 09:26
顶一下，学习到了！0.45μm过滤是除菌的对吗？实验室有0.22μm的滤膜，是不是也可以用了
作者: hzangs 时间: 2016-7-27 10:05
你只要尽可能保证无菌就可以。 毕竟后面要过0.45um滤器的。你可以用酒精泡一下和血清接触的东西 并用灭菌PBS洗一洗
作者: hzangs 时间: 2016-7-27 10:06
最好用0.45um的 尽可能少的损耗血清中的有效成分
作者: wanganbang 时间: 2016-7-27 10:27
请问有人提取过肿瘤细胞上清外泌体吗？大概能提取到多少外泌体呢？
作者: hzangs 时间: 2016-7-27 11:08
不同的细胞 提取量不同的。
作者: wanganbang 时间: 2016-7-27 14:30
请问有人提取过肿瘤细胞上清的外泌体吗？大概能提取多少呢？
作者: wanganbang 时间: 2016-7-27 14:32
嗯，谢谢，你提取过什么细胞上清的外泌体吗？我想找个参考，比如说10cm皿能提取多少ug
作者: hzangs 时间: 2016-7-27 15:09
100ml 大概10-50个ug 有些癌细胞释放量会高一些
作者: ashey 时间: 2016-7-27 15:42
多谢楼主！
作者: SoniaLi 时间: 2016-7-27 17:29
离心不用4度么？
作者: hzangs 时间: 2016-7-27 19:06
要用的！
作者: SoniaLi 时间: 2016-7-27 19:25
谢谢啦，学习啦！
作者: wanganbang 时间: 2016-7-28 15:11
谢谢，请问离心完的fbs制成培养基能加抗生素吗？
作者: hzangs 时间: 2016-7-28 16:37
可以加的。 和正常FBS 一样用
作者: wanganbang 时间: 2016-7-28 16:52
太感谢了
作者: 冷雪儿翱翔 时间: 2016-7-29 08:36
LAI XUEXI
作者: wjy 时间: 2016-7-29 17:24
强强强，太强啦
作者: cici 时间: 2016-8-16 19:57
感谢超级版主！
作者: 五仁 时间: 2016-9-17 15:53
哈哈哈哈，我好喜欢楼主的 风格！有一种神之自信！就是这个感觉不错！想和楼主做朋友
作者: dlwlrma 时间: 2016-11-16 15:16
请问楼主100，000 g可以吗
作者: hzangs 时间: 2016-11-16 15:57
没有试过 sorry~
作者: FunkyWoody 时间: 2016-11-16 17:10
厉害了，这个画工，一定是灵魂画手
作者: dlwlrma 时间: 2016-11-16 17:33
请问您能不能放几篇关于采用exosome-free FBS的文章啊？我看了一些文章，觉得处理的方法真是五花八门，有的是无血清，有的是exosome-free 的血清，还有的甚至不加血清（有些添加一些必须的因子）；我打算采用exosome-free FBS，看了您的总结很受益。
另外发现用exosome-free FBS处理的时间有的24，有的48-72h，所以想请教您是不是只要保证提取的exo够用就行，对于时间没有特别严格的要求
作者: hzangs 时间: 2016-11-16 18:35
CNS 上的paper 基本都是用exosome-free FBS，你可以随便下载几篇看一看。 关于时间，一般见到的最长的就是72小时~
作者: dlwlrma 时间: 2016-11-16 20:26
好的，感激不尽
作者: bigtmac 时间: 2017-1-19 11:16
大神大神，实验室的离心机不允许过夜，也怕管子受不了会碎，可不可以离4小时，歇10min这种，离够16H，这样可以吗？
作者: spchen035 时间: 2017-2-10 23:21
感谢楼主的干货分享！！！
作者: 晨曦 时间: 2017-2-21 14:47
好熟悉的画风，稀罕
作者: zhousisi0223 时间: 2017-2-23 15:12
楼主，请问除血清中的外泌体一定要离14-16h吗？因为是借用别的实验室的离心机，他们说机器不能过夜离心，比较危险
作者: hzangs 时间: 2017-2-23 19:56
可以考虑先配置10%FBS的培液，然后培液超离2h，过滤后用于细胞培养。 有文章报道过这个方法。文章的IF在三五分的样子。
作者: zhousisi0223 时间: 2017-2-23 21:09
好，谢谢
作者: cjr2008love 时间: 2017-2-24 12:54
写得很好，图也很卡通易懂，大赞楼主~
作者: xiaojinyuhen 时间: 2017-3-8 11:30
请问您铺的培养皿是25还是75？
作者: hzangs 时间: 2017-3-8 12:28
15cm直径的 培养皿 好像差不多相当于T75
作者: xiaojinyuhen 时间: 2017-3-8 17:22
谢谢解答1
作者: lf19860915 时间: 2017-3-27 14:56
请问，可不可以第一天离心9h，提取上清后第二天再9h，实验室老师说下班后要对大型仪器断电，所以一天最多用9h。
作者: hzangs 时间: 2017-3-27 20:50
亲， 不行的… 你可以考虑先配置成10%的含血清培液。 然后培液超离，超离完了 过0.45um的滤器。 这样就可以了。 超离时间2-3h 足够了
作者: lf19860915 时间: 2017-3-29 10:59
这种方法有文献支持吗？担心到时发文章时被审稿人要求说明。
作者: hzangs 时间: 2017-3-29 15:49
你可以自己查一下文献。 这个也是我在文件中见过的，不过使用这种方法的文献不多 ，所以记不清楚了
作者: lf19860915 时间: 2017-3-29 21:57
没有查询到使用这样方法的文献，多数使用的过夜离心血清。我在外泌体微信群里询问过一些人，说第一次离心血清吸出上清，减少过夜后的扩散和重溶，再进行第二次离心。这样可以相当于过夜离心的效果吧。另外离心好的上清是直接过滤膜还是配成培养基后过滤膜？是选用0.22um还是0.45um的滤膜？谢谢。
作者: huangjingwei24 时间: 2017-5-6 10:59
Beckman超速离心机离心16-18h 没问题的 内部都是抽真空
作者: 弹珠1253 时间: 2017-5-10 22:52
感觉还是对灭菌的问题有顾虑啊，血清应该很容易染菌的吧？
想请问下如果买exosome-free serum一般选哪个牌子呢？大概多少钱呢？
作者: lczyld 时间: 2017-5-13 23:05
楼主，啥意思，这样超离2小时就可以去除外泌体了？
作者: 鱼儿 时间: 2017-5-14 22:49
谢谢楼主
作者: hzangs 时间: 2017-5-15 09:53
是的
作者: lxy_712 时间: 2017-5-15 10:23
学习了~ 感谢分享~
作者: xuan9630 时间: 2017-5-20 15:33
很好，谢谢~
作者: lczyld 时间: 2017-5-21 22:27
请问楼主，因为借用别的实验室离心机，比较贵，所以尽可能减少时间，
可以先配成含FBS的培养液，然后超离3小时，过滤，就可以得到无外泌体的细胞培养液了？？
还有，你的细胞用这培养液培养多长时间开始提细胞分泌的外泌体
作者: hzangs 时间: 2017-5-22 10:13
第一个问题，是的。有paper这么做，只是不是主流方法。
第二个问题， 肿瘤细胞 72小时
作者: xuan9630 时间: 2017-5-23 12:22
请问各位站友，收集细胞培养基中的exosome，之后怎么知道exosome的质量呢？有详细的protocol吗？谢谢！
作者: lczyld 时间: 2017-5-27 11:55
同问！有看见BCA蛋白定量的、、、、
作者: lczyld 时间: 2017-5-27 12:17
好的，谢谢！还有，请问楼主，如果购买无外泌体的血清，在细胞培养的过程中怎么用？考虑到这种血清很贵，刚开始用普通的培养基培养，就是含10%FBS（有外泌体）的DMEM，到达状态好时，换用含血清（无外泌体）的培养基，培养一两天，然后收集细胞培养液提取外泌体，这样可以么？
作者: xuan9630 时间: 2017-6-3 20:48
这位战友，请问你在哪里看到有BCA定量的呢？能不能把出处发给我呢？还有这个BCA蛋白定量的方法的原理是什么呢？我好像只是听别人说过，但是不懂得原理，期待回复，谢谢！
作者: xuan9630 时间: 2017-6-3 20:51
请问楼主，你的exosome定量方法是BCA蛋白定量吗？原理是什么呢？求指导，谢谢！
作者: 栾珍珠 时间: 2017-6-20 16:52
请问您，海拉细胞分泌的外泌体多吗？
作者: hzangs 时间: 2017-6-21 09:04
没有试过 hela 但作为一个肿瘤细胞 它的释放量不会太低
作者: xiaoqian1219 时间: 2017-6-21 19:11
0.45um的也可以除菌吗？一直怕0.45um的不行，用0.22um的除菌损失好多，心痛！
作者: 栾珍珠 时间: 2017-6-22 09:23
好的 多谢
作者: exosor 时间: 2017-6-23 22:35
Beckman 有可以高温灭菌的管子，你可以到官网上看看。封口什么的可以在通风橱里面操作
作者: exosor 时间: 2017-6-23 22:36
Beckman 有可以高温灭菌的管子（真不是帮打广告。。。），你可以到官网上看看。封口什么的可以在通风橱里面操作
作者: CARD 时间: 2017-7-24 13:17
如果发文章的话，这种方法提出来的无外泌体血清需要自己验证吗？比如WB跑CD63，还是说是被默认有效的
作者: 小朋友玩 时间: 2017-7-25 08:41
黄老师您好，我是将细胞饥饿处理48h后收取上清分离外泌体，这个过程没有FBS，这样是不是就不需要exosome-free的FBS了？
作者: hzangs 时间: 2017-7-28 10:47
是的 你这样处理 就不许要无外泌体血清了。
作者: 牛牛 时间: 2017-8-16 17:26
大神 你用的50m离心管是什么样的管子啊？普通的50ml离心管这么弄会不会爆？
作者: hzangs 时间: 2017-8-16 19:52
我用的是日立 P28S 转头， 一管大约装38-40ml
作者: 牛牛 时间: 2017-8-17 00:00
谢谢大神~
作者: jnutsq 时间: 2017-9-1 15:56
您好，请问您说的直接FBS过滤的文献可以给我看看吗？我看有文章说“Do not deplete pure FBS because the viscosity of pure FBS will cause elimination of many proteins and factors, which will pellet as aggregates. The cells may not like it!”。就是不要直接超离FBS，而是配到培养基里面。但是这样一次制备太少了，我也想直接FBS过滤
作者: hzangs 时间: 2017-9-1 21:03
请自行搜索阅读，谢谢您的理解。
（PMID：24735924、25417103、25985394、26524530、26106858）
作者: jnutsq 时间: 2017-9-3 17:42
好的，非常感谢！
作者: jnutsq 时间: 2017-9-5 17:56
本帖最后由 jnutsq 于 2017-9-5 18:11 编辑
您好，您说的这几篇我都看了，文献的方法中都没有说Exosome free FBS的制作方法，除了这篇不能看的：25985394。请问您用这种方法提取了有发表文章吗？如果发表了，可以告知吗？
作者: jnutsq 时间: 2017-9-5 18:11
25985394，不好意思，是这篇的方法部分看不了，其它的能看
作者: kingbosbin 时间: 2017-9-14 17:54
谢谢，分享
作者: 弹珠1253 时间: 2017-10-28 18:23
马上要做了，来复习一遍
作者: lz93046 时间: 2017-11-2 16:13
这图解无懈可击
作者: caocao 时间: 2017-12-4 15:04
外泌体君！！！我用了您的方法超离血清，有个问题想问下，我们离心后有可见的沉淀，而且血清上浅下深，这个过程会不会有其他营养成分的损失？因为最后会扔一些血清，很显然扔的这一点浓度是很高的
作者: 楠楠 时间: 2017-12-19 09:26
大神，我想问一下这个无exosome-free FBS是一开始在种细胞的时候就用是吗？那细胞可以贴壁吗。
作者: nadia 时间: 2017-12-19 17:35
楼主，我按了您的方法，120000g离心了16h，用的日立的水平转子，还有0.45的滤膜过滤了，但送NTA检测还有大量外泌体，不知道可能的差错在哪里
作者: peggy4598690 时间: 2017-12-29 12:29
请问楼主，100mL是指说 10cm培养盘，一盘10mL，共10盘的意思吗? 如果想节省培养液，可以一盘10cm-dish只放5mL吗?感激不尽!!!!!!
作者: 127913abc 时间: 2018-3-7 20:40
请问学友，您这个问题解决了吗
作者: 127913abc 时间: 2018-3-7 20:41
请问站友，您这个问题解决了吗
作者: 八戒在五湖 时间: 2018-3-9 10:30
楼主，请问这个beckman提供的数据有出处吗，想引用一下
作者: 外泌体小小白 时间: 2018-7-3 20:44
请问一下大神，这个方法有木有文献支持。
作者: Jayden 时间: 2018-7-14 10:43
感谢楼主，感觉外泌体之家比干细胞之家优秀的不要太多。
作者: Jayden 时间: 2018-7-15 10:07
文献上说是100000g过夜制备无exosome FBS,我用的是100000g过夜请问能除去血清中 的exosome吗？
作者: Jayden 时间: 2018-7-15 10:51
有文献支持吗
作者: 爱学习 时间: 2018-9-1 15:55
您好，有两个问题想请教一下：
1. 第一次收集了上清的细胞还能继续用再培养收集下一次，这样外泌体产量是否有降低，影响大吗？
2. 看文献有的是在细胞传代后培养到汇合度达到90%再换成exo-free的培养基继续培养48h，您这是直接传代时候就换成exo-free了。不知道您是否有尝试过这种方法呢/?
作者: 仙逆清水 时间: 2019-4-27 14:45
谢谢楼主
作者: meon_zhao 时间: 2019-5-9 19:30
超速离心会把蛋白离下来吗？上清的FBS里的蛋白成分是不是会损失啊
作者: meon_zhao 时间: 2019-5-9 19:32
超速离心会把蛋白离下来吗？上清的FBS里的蛋白成分是不是会损失啊
作者: Mango 时间: 2019-8-2 17:38
能问一下无exo的培养基存放时间是一定要在4周之内吗？有说明原因的文献推荐吗？
作者: zander 时间: 2019-10-15 11:36
请问一下大佬，前面那个方法，先配置百分之20的培养基，是统一标准吗？我的细胞是用百分之10FBS进行培养，我是不只要配百分之10的就行，然后再去超离。貌似问题有点尴尬
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