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标题: 超离提取exo底部沉淀问题 [打印本页]
作者: stones    时间: 2016-8-11 20:27
标题: 超离提取exo底部沉淀问题
本帖最后由 stones 于 2016-8-11 20:29 编辑

210ml的MSC无血清培养上清，第一次离心的时候没有看到沉淀，最后用100ulPBS重悬，BCA测浓度在20ug/ml左右。接着又超离了210ml的上清，这次看到了沉淀，在离心管底部一圈白色的沉淀，最后用PBS重悬，不好溶，贴的很紧，最后用250ul的PBS连刮带吹打了50+次，转移到EP管内；浓度待测。请教各位，这个沉淀是不是exosomes？我这个浓度是不是太低了。
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作者: sldingxiang    时间: 2016-8-12 11:21
看图片你用的应该是固定角的转子，沉淀不应该是在“底部一圈”，而是在 放置离心管时朝上一侧的壁和底部的交接部位。不知道表述的够不够清楚
作者: stones    时间: 2016-8-12 12:21
sldingxiang 发表于 2016-8-12 11:21
看图片你用的应该是固定角的转子，沉淀不应该是在“底部一圈”，而是在 放置离心管时朝上一侧的壁和底部的 ...

不是固定转子，是水平的，SW32Ti。
作者: stones    时间: 2016-8-13 16:29
哪位大神也看到过类似的沉淀啊？求解答。浓度是不是太低了呢？
作者: hzangs    时间: 2016-8-16 16:59
超离的血清么？
作者: stones    时间: 2016-8-16 23:16
hzangs 发表于 2016-8-16 16:59
超离的血清么？

是无血清培养的MSC。今天把有沉淀的那管exo（250ul PBS重悬的）测了浓度，在110ug/ml左右。比第一次测得高了10倍，但和论坛里其他人超离的比较起来，还是差了几倍啊。但是和Thery2006的经典protocol里的浓度比较：10·6个细胞得到0.5ug外泌体；我大概有10·8个细胞，210ml这次测得有110ug/ml*0.25ml=27.5ug，换算下来，10·6个细胞得到了0.275ug外泌体；这样比较起来也只差了2倍左右。坛子的高手们，我这个浓度到底是一个什么水平呢？求指导！蟹蟹
作者: hzangs    时间: 2016-8-17 09:44
stones 发表于 2016-8-16 23:16
是无血清培养的MSC。今天把有沉淀的那管exo（250ul PBS重悬的）测了浓度，在110ug/ml左右。比第一次测得 ...

分泌量和细胞类型 及细胞状态有密切关系。   
你超离完以后是倒的上清还是吸取的上清？
作者: stones    时间: 2016-8-17 09:49
hzangs 发表于 2016-8-17 09:44
分泌量和细胞类型 及细胞状态有密切关系。   
你超离完以后是倒的上清还是吸取的上清？ ...

超离后是用25ml的移液管吸得，按照protocol，第一次10万g超离后，弃去上清至0.5cm，PBS冲洗每管后转移到新的离心管。第二次10万g超离后，看见沉淀后用移液管吸大部分，剩余小部分用1ml枪头贴管壁和液面慢慢吸弃掉上清的。蟹蟹版主及时回复，110ug/ml这个浓度对于MSC的上清是个什么水平啊？
作者: hzangs    时间: 2016-8-17 10:05
stones 发表于 2016-8-17 09:49
超离后是用25ml的移液管吸得，按照protocol，第一次10万g超离后，弃去上清至0.5cm，PBS冲洗每管后转移到 ...

MSC 我没有试过。 但是按照johnny的说法  他之前做MSC 感觉分泌量还不错
作者: stones    时间: 2016-8-17 10:11
蟹蟹版主！打算按照你的建议再试一次。@Johnny，Johny大神求指导啊。
作者: wjy    时间: 2016-9-12 16:30
hzangs 发表于 2016-8-17 09:44
分泌量和细胞类型 及细胞状态有密切关系。   
你超离完以后是倒的上清还是吸取的上清？ ...

超离后上清倒和吸有关系吗？我一般都是倒，然后底部在用枪吸
作者: hzangs    时间: 2016-9-12 16:38
wjy 发表于 2016-9-12 16:30
超离后上清倒和吸有关系吗？我一般都是倒，然后底部在用枪吸

有关系！
作者: wjy    时间: 2016-9-17 16:57
hzangs 发表于 2016-9-12 16:38
有关系！

那应该是洗还是到啊？你平时怎么做啊？
作者: hzangs    时间: 2016-9-17 20:30
wjy 发表于 2016-9-17 16:57
那应该是洗还是到啊？你平时怎么做啊？

要从上方吸走，不要倒~
作者: 白色公子    时间: 2017-1-9 20:53
你这管子是不是30ml的量
作者: malingran    时间: 2017-6-24 16:50
hzangs 发表于 2016-9-17 20:30
要从上方吸走，不要倒~

您的意思是除了沉淀，底部的上清也可能含有外泌体?是这个原因还是什么原因呢
作者: weixiduan    时间: 2017-9-27 21:23
请问是怎样测外泌体浓度的
作者: lz93046    时间: 2017-11-2 16:11
量好少的感觉。
作者: gj417439623    时间: 2017-11-15 16:42
hzangs 发表于 2016-8-17 10:05
MSC 我没有试过。 但是按照johnny的说法  他之前做MSC 感觉分泌量还不错

前辈，你好，我想请教一下。我用人血浆提外泌体，之前查的步骤说是要用pbs和血浆等体积混匀后进行离心，我今天用少量的血浆，3ml加了3mlpbs做了一下，最后没有可见沉淀。但我看好多文献里没有写稀释血浆的这一步，想请教一下，究竟要不要稀释呢？
作者: hzangs    时间: 2017-11-16 18:44
gj417439623 发表于 2017-11-15 16:42
前辈，你好，我想请教一下。我用人血浆提外泌体，之前查的步骤说是要用pbs和血浆等体积混匀后进行离心， ...

稀释倍数小了。  你尝试一下10倍-20倍稀释，  可以考虑过夜离心
作者: gj417439623    时间: 2017-11-16 18:50
hzangs 发表于 2017-11-16 18:44
稀释倍数小了。  你尝试一下10倍-20倍稀释，  可以考虑过夜离心

好的，请教一下您。这个稀释的作用是什么啊？稀释倍数大一点，得率会更高么？
作者: Kaku    时间: 2019-3-31 10:48
hzangs 发表于 2016-9-12 16:38
有关系！

借楼问下版主。我也是干细胞来源的无血清培养基。有的时候会遇到这种黏黏的东西聚集在底部，越吹越粘，有时候用枪头一挑还拉丝，去nano drop测bca几乎就没有。这种情况时有时无，容易吹开的批次浓度能有4mg/ml。版主有没有在细胞培养条件上面的建议，如何避免这种粘稠物。谢谢。
作者: idealZHENG1991    时间: 2019-5-23 14:54
Kaku 发表于 2019-3-31 10:48
借楼问下版主。我也是干细胞来源的无血清培养基。有的时候会遇到这种黏黏的东西聚集在底部，越吹越粘，有 ...

层主我也遇到了你同样的问题，请问这种沉淀到底要不要，是不是外泌体？层主最后是怎么解决的呢
作者: xlyz    时间: 2019-7-2 11:42
怎么测的浓度呀？
作者: talentsunkai    时间: 2019-7-13 16:16
我是倒掉的 270ml培养液只有4ug，下次准备尝试吸，不知道需要留多少不吸？
作者: iiiiiisuur    时间: 2021-9-26 19:00
Kaku 发表于 2019-3-31 10:48
借楼问下版主。我也是干细胞来源的无血清培养基。有的时候会遇到这种黏黏的东西聚集在底部，越吹越粘，有 ...

我也遇到过这种，吹都吹不散，和朋友讨论有没有可能是DNA，但是也不敢用核酸酶处理，请问有知道怎么解决的吗？
作者: KKruru    时间: 2021-11-11 16:20
Kaku 发表于 2019-3-31 10:48
借楼问下版主。我也是干细胞来源的无血清培养基。有的时候会遇到这种黏黏的东西聚集在底部，越吹越粘，有 ...

同问，求解



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