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标题: 新鲜出炉的电镜求鉴定 [打印本页]
作者: grapetian    时间: 2016-9-20 17:29
标题: 新鲜出炉的电镜求鉴定
请大神们帮我鉴定下电镜图，为什么我同一个样品做出来的囊泡大小都有，30nm-150nm不等,还有几个200nm左右的。 形态也各异，什么样的都有。样品是细胞上清液超离得到的。另外背景也不干净，电镜老师说是蛋白污染。还有丝状的不知道是什么？
作者: grapetian    时间: 2016-9-21 16:06
Johnny 发表于 2016-9-20 17:47
那些小的是外泌体，大的是shedding vesicle了。背景不干净确实是蛋白的污染。

总体来说，你的电镜效果还是 ...

那要怎么样可以除去蛋白污染，让背景干净点？pbs多洗几遍吗？
作者: jzhou65    时间: 2016-9-24 00:11
请问您具体是怎么提取的啊？谢谢！
作者: Odie    时间: 2016-9-24 12:46
估计你用的离心法测的吧。会有很多细胞碎片等杂质（提取试剂盒本人测试效果不错，大小比较均一），制样的时候也要保证干净（包括上样片），最后一个是适宜的浓度。
作者: grapetian    时间: 2016-9-26 12:24
jzhou65 发表于 2016-9-24 00:11
请问您具体是怎么提取的啊？谢谢！

超速离心法提取的  收集细胞培养上清，300g 10min  2000g 20min  10000g 30min  100000g 1h, pbs洗一遍 100000g 1h  
作者: grapetian    时间: 2016-9-26 12:37
Odie 发表于 2016-9-24 12:46
估计你用的离心法测的吧。会有很多细胞碎片等杂质（提取试剂盒本人测试效果不错，大小比较均一），制样的时 ...

对啊 我用的超离，你用什么试剂盒提取的？
作者: 中义    时间: 2016-9-29 12:49
应该在去上清时彻底一点，留上清时保守一点，这样有助于减少蛋白污染。
作者: 小七果果8    时间: 2016-10-1 10:46
请问如果暂时没有100000g的离心机可以用，后面几步用8000g的是不是完全没有意义，根本不可能提出外泌体，求助~
作者: 五仁    时间: 2016-10-9 23:33
楼主超速离心的时候，最后用pbs重悬，我看文献上说用20微升到50微升经行，但是原本离心管壁上就有液体，怎么 处理？50微升的PBS加入到那么大的超速离心管中，就和大海捞针一样，怎么重悬？感谢楼主能够排疑
作者: grapetian    时间: 2016-10-10 13:14
五仁 发表于 2016-10-9 23:33
楼主超速离心的时候，最后用pbs重悬，我看文献上说用20微升到50微升经行，但是原本离心管壁上就有液体，怎 ...

不是啊，你离心的话肯定是pbs要加满超离管的，最后一步是加20-30ul重悬后做鉴定
作者: 五仁    时间: 2016-10-10 13:54
grapetian 发表于 2016-10-10 13:14
不是啊，你离心的话肯定是pbs要加满超离管的，最后一步是加20-30ul重悬后做鉴定 ...

是的，就是这个加20到50微升PBS鉴定，在这之前，管壁内的液体倒掉，但还是里边还是有液体啊，PBS重悬pellet，吸出来可能就100微升了。
作者: grapetian    时间: 2016-10-11 13:34
我都是用枪吸干的
作者: dancing    时间: 2016-10-14 10:39
Odie 发表于 2016-9-24 12:46
估计你用的离心法测的吧。会有很多细胞碎片等杂质（提取试剂盒本人测试效果不错，大小比较均一），制样的时 ...

请问你用的什么牌子的提取试剂盒，我用试剂盒提取的杂蛋白很多，拍电镜背景很难看
作者: 陈陈陈Rachel    时间: 2016-10-14 12:08
楼主的电镜图好棒啊 我的电镜图感觉看不到外泌体 我想请教一下 第一次100000g离心之后 弃上清是直接用加样枪吸干么 就是液体全部都吸走么 还有再加入PBS还要混匀吗 求告知



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