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标题: 求助！试剂盒提取血清exosomes [打印本页]

作者: 哈利郭特 时间: 2015-3-13 15:26
标题: 求助！试剂盒提取血清exosomes
各位大神我用了life和SBI的试剂盒提血清的exosomes感觉总是有问题
SBI说明书后边有一个做western的protocol
1. If frozen, thaw culture media or urine sample on ice
2. Combine 500µl serum + 120 µl ExoQuick
3. Mix well by inversion three times
4. Place at 4ºC for 30 minutes (or up to12 hours)
5. Centrifuge at 1500 × g for 30 minutes
6. Remove supernatant, keep exosome pellet
7. Centrifuge at 1500 × g for 5 minutes to remove all traces of fluid (take great care not to disturb the pellet)
8. Add 200 µl RIPA buffer to exosome pellet and vortex 15 seconds
9. Place at room temperature for 5 minutes (to allow complete lysis)
10. Add Laemmli buffer (with Beta-mercaptoethanol) and heat at 95⁰C for 5 minutes.
11. Chilled on ice for 5 minutes before loading onto gel
12. Perform standard SDS-PAGE electrophoresis and Western transfer onto PVDF membrane
13. Block with 5% dry milk in Tris Buffered Saline + 0.05% Tween (TBS-T) for 1 hour
14. Incubate blot overnight at 4°C with SBI's exosome specific antibody (e.g. CD9) at 1:1000 dilution (5% dry milk in TBS-T)
15. Wash 3X with TBS-T
16. Incubate one hour at room temperature with SBI's Goat anti-Rabbit-HRP antibody at 1:20,000 dilution (5% dry milk in
TBS-T)
17. Wash 3X with TBS-T
18. Incubate blot with chemi-luminescence substrate and visualize on film or other imaging equipment

我基本上是按照说明书做的但是做了很多次都没有结果请问500ul血清能不能提出eoxosmes？加入试剂之后会看到明显的黄色沉淀用RIPA裂解液可以重悬但感觉好像不能完全裂解有没有必要再离心一下去除沉淀？有没有什么注意事项求指点试剂盒都快用完了一个条带都木有

谢谢！

作者: 哈利郭特 时间: 2015-3-13 15:52
补充一下最初是500ul的血清用100ulRAPA裂解液溶解 5XLOADING buffer 最后上样量是28ul左右求指教！

作者: xuemei7868650 时间: 2015-3-13 16:16
同样疑惑，同求

作者: 哈利郭特 时间: 2015-3-13 18:08
报告版主我只检测了CD63 莫非是人血清里CD63含量太低了？而且我觉得有点不可思议用差速离心的方法500ul的血清加上PBS后 110 000g 离心2h 沉淀根本看不到但是用试剂盒居然有很大一坨我觉得有点难以置信请教版主能不能分享一下你做western的步骤呀还有从培养基里提exosomes超速离心的方法一般要100ml甚至更多 500ul的血清真的能提出来吗？万分感激！还有个问题哈用超速离心的方法去除培养基中的exosomes 能不能时间短一点呀我看protocol上班说要110 000g 过夜这也太长了 4h够不够？谢谢！

作者: fan 时间: 2015-3-14 11:21

哈利郭特发表于 2015-3-13 15:52
补充一下最初是500ul的血清用100ulRAPA裂解液溶解 5XLOADING buffer 最后上样量是28ul左右求指教！ ...

个人感觉你的蛋白浓度很高的。500Ul血清应该是能提取很多的。当然杂蛋白肯定有。不妨你把蛋白的浓度做个不同的稀释浓度，在跑跑看！

作者: 哈利郭特 时间: 2015-3-16 16:00

Johnny 发表于 2015-3-13 21:12
我觉得试剂盒提出来的那一大坨很可能是杂蛋白，不是exosome。阳性样本如果能杂出来，就肯定不是你WB的问 ...

多谢～我再研究研究

作者: 哈利郭特 时间: 2015-3-16 16:01

fan 发表于 2015-3-14 11:21
个人感觉你的蛋白浓度很高的。500Ul血清应该是能提取很多的。当然杂蛋白肯定有。不妨你把蛋白的浓度做 ...

thanks～我回头试一下

作者: hzangs 时间: 2015-3-18 10:04

哈利郭特发表于 2015-3-13 18:08
报告版主我只检测了CD63 莫非是人血清里CD63含量太低了？而且我觉得有点不可思议用差速离心的方法500ul ...

个人感觉，可以考虑换一个抗体杂一杂，不同组织和细胞分泌的exosome所携带的表面蛋白marker的丰度存在一定差异。

作者: 哈利郭特 时间: 2015-3-18 17:14

hzangs 发表于 2015-3-18 10:04
个人感觉，可以考虑换一个抗体杂一杂，不同组织和细胞分泌的exosome所携带的表面蛋白marker的丰度存在一 ...

好的谢谢指点～

作者: 大琳宝儿 时间: 2015-4-5 13:32
插问一个很细节的问题，再用SBI试剂盒提取的时候，加完提取液，他说要Refrigerate30,min，这个是冷冻还是冷藏啊 4度还是-20？
另外，我通过研磨组织，提取组织细胞间液的exosome，加的比例和时间很难掌握，我看SBI试剂盒对腹液的要求是12h，那组织间液是不是野德挺长时间啊？嘿嘿自己实在没注意了，大家一起帮我参谋参谋~谢谢啦

作者: iiibuick 时间: 2015-9-9 08:29
刚买了个SBI的试剂盒，也是提取细胞培养液里的exosome的，还没开始做，但是说明书里说的 use as little as 5mL media or urine samples，你会不会用的太少了

作者: hzangs 时间: 2015-10-9 10:53
qEV exosome分离柱可以的。我尝试过它分离血清中的外泌体还行，也比较干净

作者: 子非鱼 时间: 2016-1-14 11:05

哈利郭特发表于 2015-3-18 17:14
好的谢谢指点～

时间久远，不知道楼主做得怎么样了？

作者: xinyi717 时间: 2016-1-15 10:35
同样想问下楼主，不知现在如何呢？谢谢

作者: zyjjxb 时间: 2016-4-1 16:25
我也是啊，血清600ul.用试剂盒提取后黄色粘稠状沉淀比较多，加入裂解液，想吹打下都沾在枪头上了，BCA测蛋白浓度太可怕，都上万了！

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