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标题: SBI试剂盒提取培养液及血清外泌体protocol [打印本页]
作者: yuantingdong    时间: 2016-10-17 15:58
标题: SBI试剂盒提取培养液及血清外泌体protocol
请教一下，我整理了一下SBI试剂盒提取培养液和血清外泌体的步骤，麻烦用SBI提取外泌体的亲们帮我审阅审阅呗，十分感谢！
作者: 芮苏遥    时间: 2016-10-19 10:44
上个月用了SBI试剂盒提了细胞培液的外泌体，提了三种细胞，有两种细胞同上操作没有看到离心沉淀的外泌体。不知道楼主有没有碰到过这种情况。
收取培液的方法：
细胞密度达约80%后，换无血清的纯培培养48h以上，过程中细胞状态良好。
共收取了35ml的培液，去除细胞碎片后，按照5:1加入SBI exoquick TC，混匀静置过夜离心，未见沉淀
作者: 我是小白    时间: 2016-10-20 09:55
请问提取出来的杂蛋白那么多，如何验证蛋白是位于外泌体上或者内呢？
作者: yuantingdong    时间: 2016-10-21 11:20
芮苏遥 发表于 2016-10-19 10:44
上个月用了SBI试剂盒提了细胞培液的外泌体，提了三种细胞，有两种细胞同上操作没有看到离心沉淀的外泌体。 ...

我还没做，不过这个应该跟细胞有关吧，另外之前论坛里也有人说，看不见不意味着没有，接着做试试？做了再和你交流哈
作者: 芮苏遥    时间: 2016-10-23 23:40
yuantingdong 发表于 2016-10-21 11:20
我还没做，不过这个应该跟细胞有关吧，另外之前论坛里也有人说，看不见不意味着没有，接着做试试？做了再 ...

好的。我今天用了life的试剂盒提了下细胞培液上清。1ml+0.5ml提取试剂，离心有看到沉淀，还没做过鉴定。不过这是另一种细胞，1毫升的培液上清就能看到沉淀，相比之前35毫升还看不到沉淀的提取让人欣慰多了
作者: 蛮夷不蛮    时间: 2016-10-25 10:52
楼主 你有用SBI公司的CD9检测试剂盒吗？
作者: cluo83    时间: 2016-10-25 14:14
血清的为什么不多加一步12000g离心，然后0.22um过滤一下？
作者: yuantingdong    时间: 2016-10-27 16:12
cluo83 发表于 2016-10-25 14:14
血清的为什么不多加一步12000g离心，然后0.22um过滤一下？

恩，我觉得应该可以，本来超离就有这一步嘛，我后续也加了过滤。你做了没？效果如何？谢谢
作者: yuantingdong    时间: 2016-10-27 16:14
芮苏遥 发表于 2016-10-23 23:40
好的。我今天用了life的试剂盒提了下细胞培液上清。1ml+0.5ml提取试剂，离心有看到沉淀，还没做过鉴定。 ...

我用培养液15ml，提出来沉淀挺多的，不过还没鉴定，怎么看到底纯不纯呢？
作者: dlwlrma    时间: 2016-10-30 11:37
芮苏遥 发表于 2016-10-23 23:40
好的。我今天用了life的试剂盒提了下细胞培液上清。1ml+0.5ml提取试剂，离心有看到沉淀，还没做过鉴定。 ...

请问你用的什么细胞呀？1ml就能看到沉淀呀?
作者: cluo83    时间: 2016-10-31 11:22
yuantingdong 发表于 2016-10-27 16:12
恩，我觉得应该可以，本来超离就有这一步嘛，我后续也加了过滤。你做了没？效果如何？谢谢 ...

我还没做，我因为RNA和蛋白都要分析，又是血浆样本，但不想用超离，所以还没选好用那种方法。SBI的总觉得沉淀下来的会有大量杂蛋白吧。。
作者: 芮苏遥    时间: 2016-11-8 14:37
yuantingdong 发表于 2016-10-27 16:14
我用培养液15ml，提出来沉淀挺多的，不过还没鉴定，怎么看到底纯不纯呢？ ...

CD63，CD9，CD81跑WB定量？SBI 说明书后面有写这些是exosomal marker antibodies
作者: 芮苏遥    时间: 2016-11-8 14:39
dlwlrma 发表于 2016-10-30 11:37
请问你用的什么细胞呀？1ml就能看到沉淀呀?

我们主要是做消化道肿瘤的，我用的是LOVO-GFP细胞和life的试剂盒，据说沉淀杂质挺多的。要求高的话最好还是超离吧
作者: 五月灼蓁    时间: 2016-12-8 21:19
请问一下提细胞培养液外泌体用的试剂盒是这个吗
ExoQuick-TC™
Exosome Precipitation Solution
Cat# EXOTC10A-1
作者: katuysha    时间: 2017-3-22 14:09
芮苏遥 发表于 2016-11-8 14:39
我们主要是做消化道肿瘤的，我用的是LOVO-GFP细胞和life的试剂盒，据说沉淀杂质挺多的。要求高的话最好还 ...

你好，请问你们做WB了吗？有结果吗？我这两天用life的kit提的细胞上清和血浆的外泌体，WB 都没有结果。
作者: 芮苏遥    时间: 2017-4-10 09:29
katuysha 发表于 2017-3-22 14:09
你好，请问你们做WB了吗？有结果吗？我这两天用life的kit提的细胞上清和血浆的外泌体，WB 都没有结果。 ...

请问你是用多少ml来源的上清和血浆做的啊？我的1ml上清来源外泌体的WB CD68没结果，猜测是外泌体量少，裂解液稀释蛋白，或者抗体不好用
作者: katuysha    时间: 2017-4-10 13:34
芮苏遥 发表于 2017-4-10 09:29
请问你是用多少ml来源的上清和血浆做的啊？我的1ml上清来源外泌体的WB CD68没结果，猜测是外泌体量少，裂 ...

我用的也是1ml的量，WB一个条带都没有。应该是exosomes的量太少，不过我用的血浆样品年代比较久远，不知道是不是这方面的原因。
作者: zergbloody    时间: 2017-4-15 10:54
katuysha 发表于 2017-4-10 13:34
我用的也是1ml的量，WB一个条带都没有。应该是exosomes的量太少，不过我用的血浆样品年代比较久远，不知 ...

您好，请问血浆提取的步骤和血清有什么区别呢？我刚开始做，想用SBI的试剂提取血浆外泌体。谢谢！
作者: katuysha    时间: 2017-4-17 09:45
zergbloody 发表于 2017-4-15 10:54
您好，请问血浆提取的步骤和血清有什么区别呢？我刚开始做，想用SBI的试剂提取血浆外泌体。谢谢！ ...

根据你kit的protocol说明吧，我没用过SBI的，估计没有很大的区别。
作者: zergbloody    时间: 2017-4-17 20:29
katuysha 发表于 2017-4-17 09:45
根据你kit的protocol说明吧，我没用过SBI的，估计没有很大的区别。

好滴，麻烦啦
作者: 芮苏遥    时间: 2017-4-18 12:42
katuysha 发表于 2017-4-10 13:34
我用的也是1ml的量，WB一个条带都没有。应该是exosomes的量太少，不过我用的血浆样品年代比较久远，不知 ...

请问下，其他来源外泌体的标志蛋白 WB验证 有出条带嘛？
作者: 芮苏遥    时间: 2017-4-18 12:46
zergbloody 发表于 2017-4-15 10:54
您好，请问血浆提取的步骤和血清有什么区别呢？我刚开始做，想用SBI的试剂提取血浆外泌体。谢谢！ ...

linvitrogen有针对CM,plasma，serum 的exosome提取试剂盒。最近在做血浆外泌体的提取
作者: katuysha    时间: 2017-4-18 17:34
芮苏遥 发表于 2017-4-18 12:42
请问下，其他来源外泌体的标志蛋白 WB验证 有出条带嘛？

kit沉淀完后，加一步洗脱，用大体积的PBS洗去杂蛋白，再离心收集，这样就可以用WB做出结果。只是这样会损失大量的外泌体。
作者: 芮苏遥    时间: 2017-4-19 01:12
katuysha 发表于 2017-4-18 17:34
kit沉淀完后，加一步洗脱，用大体积的PBS洗去杂蛋白，再离心收集，这样就可以用WB做出结果。只是这样会损 ...

是将试剂盒提取出的外泌体用PBS重悬，然后用10000g再次离心取沉淀的意思吗？请问下大概需要多少的量，谢谢~~~
作者: katuysha    时间: 2017-4-19 14:13
芮苏遥 发表于 2017-4-19 01:12
是将试剂盒提取出的外泌体用PBS重悬，然后用10000g再次离心取沉淀的意思吗？请问下大概需要多少的量，谢 ...

是的，PBS需要20-30ML，离心力越大越好。
作者: 芮苏遥    时间: 2017-4-21 11:09
katuysha 发表于 2017-4-19 14:13
是的，PBS需要20-30ML，离心力越大越好。

下次试试，非常感谢！
作者: waimiti    时间: 2017-11-7 01:34
katuysha 发表于 2017-4-18 17:34
kit沉淀完后，加一步洗脱，用大体积的PBS洗去杂蛋白，再离心收集，这样就可以用WB做出结果。只是这样会损 ...

请教一下您，如何洗脱，是1500g ,5min中离心之后再加PBS洗脱么？离心力和时间怎么定？谢谢
作者: katuysha    时间: 2017-11-8 13:38
waimiti 发表于 2017-11-7 01:34
请教一下您，如何洗脱，是1500g ,5min中离心之后再加PBS洗脱么？离心力和时间怎么定？谢谢 ...

就是在用kit得到你的最终沉淀之后啊，离心力是越大越好，同理，时间也是越久越好。
作者: guodier    时间: 2017-12-22 12:02
感谢 mark
作者: JKF    时间: 2017-12-22 17:07
血清提取的话，也是要离心30分钟吧



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