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标题: 做WB前外泌体处理 [打印本页]
作者: yuantingdong    时间: 2016-10-19 08:31
标题: 做WB前外泌体处理
请教一下，外泌体抽提后做WB，但不是立马做，是用PBS溶解放-80°C保存吗？如果这样，在提取蛋白之前用多大离心力可以把外泌体从PBS中分离沉淀出来？谢谢！
作者: hzangs    时间: 2016-10-19 09:48
一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的
作者: yuantingdong    时间: 2016-10-19 10:06
hzangs 发表于 2016-10-19 09:48
一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的 ...

我们这边超速离心不方便，那是不是意味着每次提外泌体之后就要立马提蛋白？谢谢！
作者: 君扬2009    时间: 2016-10-19 10:33
hzangs 发表于 2016-10-19 09:48
一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的 ...

斑竹   我看06年Thery的文章说 从人来源分离的外泌体时，裂解液不加DTT和巯基乙醇。请问你们一般用的是什么裂解液呢？还有就是论坛下载的06年Thery的文献只有29页，是不是还有补充呢？谢谢
作者: hzangs    时间: 2016-10-19 14:42
yuantingdong 发表于 2016-10-19 10:06
我们这边超速离心不方便，那是不是意味着每次提外泌体之后就要立马提蛋白？谢谢！ ...

一般我会把外泌体样品 重悬在约100ul PBS中，取部分做蛋白定量，然后剩下的直接冻在-20。  用的时候吸取一部分 加6*loading 煮
作者: yuantingdong    时间: 2016-10-19 16:51
hzangs 发表于 2016-10-19 14:42
一般我会把外泌体样品 重悬在约100ul PBS中，取部分做蛋白定量，然后剩下的直接冻在-20。  用的时候吸取 ...

但是重悬在PBS中后，就必须得超离后才能提蛋白，不能直接处理，问题是我这边不能超离，那是不是就得分开做？
作者: hzangs    时间: 2016-10-19 20:57
yuantingdong 发表于 2016-10-19 16:51
但是重悬在PBS中后，就必须得超离后才能提蛋白，不能直接处理，问题是我这边不能超离，那是不是就得分开 ...

不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可
作者: wxz    时间: 2016-10-20 12:39
提外泌体蛋白不用裂解液么。先前我用RIPA感觉裂的不是很彻底，打算换4%的SDS呢。看好多文献直接加P
BS
作者: yuantingdong    时间: 2016-10-21 11:23
hzangs 发表于 2016-10-19 20:57
不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可

请问版主，加loading煮了之后直接上样吗？我第一次听说可以这样，不提蛋白如何做WB，望不吝赐教！谢谢
作者: yuantingdong    时间: 2016-10-21 11:25
hzangs 发表于 2016-10-19 20:57
不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可

版主有没有具体的步骤或者其链接或者文献，最近要做这个，谢谢了！
作者: gqq    时间: 2017-3-2 11:25
楼主后来怎么做的？我是外泌体沉淀后加了50ul的PBS重悬，跑WB之前还需特别做什么吗？
作者: 猫头鹰爱睡觉觉    时间: 2017-3-2 11:35
我超离的exo，沉淀直接加20ulPBS重悬，冻在-80度一个月后跑WB都可以，直接加5X loading buffer 98度变性5分钟就可以上样了
作者: meiling    时间: 2017-5-29 09:57
hzangs 发表于 2016-10-19 09:48
一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的 ...

您好。我想请教您几个问题：1、如何对细胞培养上清液进行外泌体定量呢？2、如何对外泌体上CD63蛋白定量呢？请不吝赐教，多谢！
作者: hzangs    时间: 2017-5-29 11:17
meiling 发表于 2017-5-29 09:57
您好。我想请教您几个问题：1、如何对细胞培养上清液进行外泌体定量呢？2、如何对外泌体上CD63蛋白定量呢 ...

1、定量方法要么使用蛋白定量如BCA等，要么使用粒子数定量 如NTA等。
2、ELISA
作者: meiling    时间: 2017-5-30 20:48
好的 多谢 啦
作者: shuhun    时间: 2017-6-9 15:30
请问用试剂盒提取的外泌体如何做WB
作者: 八戒在五湖    时间: 2017-6-19 11:41
hzangs 发表于 2017-5-29 11:17
1、定量方法要么使用蛋白定量如BCA等，要么使用粒子数定量 如NTA等。
2、ELISA ...

请问一下，外泌体重悬于PBS后，直接BCA定量吗，需要加裂解液不
作者: YEZENG    时间: 2017-6-21 10:29
君扬2009 发表于 2016-10-19 10:33
斑竹   我看06年Thery的文章说 从人来源分离的外泌体时，裂解液不加DTT和巯基乙醇。请问你们一般用的是什 ...

你说的06年Thery的文章是什么文章？可以给我也发一份吗？谢谢
作者: YEZENG    时间: 2017-6-21 10:32
hzangs 发表于 2016-10-19 20:57
不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可

是直接加上样缓冲液后直接煮，然后跑weatern blot就行了是吧？我刚开始做，想跑一下标记蛋白，CD63，CD9之类的
作者: hzangs    时间: 2017-6-21 12:33
YEZENG 发表于 2017-6-21 10:32
是直接加上样缓冲液后直接煮，然后跑weatern blot就行了是吧？我刚开始做，想跑一下标记蛋白，CD63，CD9 ...

嗯嗯
作者: 步步唧唧    时间: 2017-6-29 11:05
hzangs 发表于 2017-6-21 12:33
嗯嗯

版主 问一下 提取到的外泌体跑WB，是exo直接加缓冲液煮，然后直接做跑WB吗？那不是所有蛋白都会跑出来吗？怎么鉴定标志戴白CD9\CD63\TSG101什么的啊？如何区分？用什么Marker
作者: yh161    时间: 2017-8-2 22:39
hzangs 发表于 2017-5-29 11:17
1、定量方法要么使用蛋白定量如BCA等，要么使用粒子数定量 如NTA等。
2、ELISA ...

请问楼主，那BCA怎么测呢？  pbs重悬之后就直接用BCA测吗？不用加裂解液吗？
作者: 纪南方    时间: 2017-8-3 09:34
请问大神们用的是哪家的抗体啊?
作者: EV-yyb    时间: 2017-10-20 23:37
猫头鹰爱睡觉觉 发表于 2017-3-2 11:35
我超离的exo，沉淀直接加20ulPBS重悬，冻在-80度一个月后跑WB都可以，直接加5X loading buffer 98度变性5分 ...

那请问你加多少loading，上多少外泌体的量呢？
作者: atropine90    时间: 2017-10-31 21:09
步步唧唧 发表于 2017-6-29 11:05
版主 问一下 提取到的外泌体跑WB，是exo直接加缓冲液煮，然后直接做跑WB吗？那不是所有蛋白都会跑出来吗 ...

感觉这位层主连WB的原理都不清楚啊.... 敷抗体啊！
作者: lz93046    时间: 2017-11-1 22:04
上多少样呢？
作者: 布酱    时间: 2018-3-22 09:11
hzangs 发表于 2017-6-21 12:33
嗯嗯

新手一枚，请问hzangs老师，做WB前期处理上样缓冲液一般用什么，金属浴还是水浴？时间是多久？
作者: hzangs    时间: 2018-3-22 11:47
布酱 发表于 2018-3-22 09:11
新手一枚，请问hzangs老师，做WB前期处理上样缓冲液一般用什么，金属浴还是水浴？时间是多久？ ...

跟常规的WB 一样操作即可
作者: 布酱    时间: 2018-3-22 14:23
hzangs 发表于 2018-3-22 11:47
跟常规的WB 一样操作即可

好的，谢谢
作者: zhangning    时间: 2018-11-18 21:18
楼主楼主，现在求教，pbs重悬的exo到底应该怎么处理
作者: zhaojing    时间: 2018-11-28 17:46
求版主赐教在提取样品，重悬在PBS后进行WB的步骤，包括加loading煮的推介量呀
作者: DBLB    时间: 2019-10-21 13:20
zhaojing 发表于 2018-11-28 17:46
求版主赐教在提取样品，重悬在PBS后进行WB的步骤，包括加loading煮的推介量呀 ...

多少都行，粒子数够，几微升都跑的出来。



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