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标题: 麻烦大神们鉴定一下电镜图 [打印本页]
作者: pytruth 时间: 2016-10-30 23:14
标题: 麻烦大神们鉴定一下电镜图
本帖最后由 hzangs 于 2016-10-31 12:37 编辑
最近从试剂法提取转换到超离法提取外泌体，尝试了从血清和细胞上清里提取外泌体。2ml血清用PBS稀释至12ml、48ml 培液先浓缩成12ml超速离心分离得到的外泌体，重悬于100ul PBS中。吸取样品20ul 滴加于铜网上沉淀10min，滤纸吸去浮液，吸去醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀90s，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，上机观察。都是一个个白球，不知道是不是？而且可能由于我提取完之后4度放了三天再做电镜，有点团聚。最近正在赶实验，麻烦各位大神看到了一定给鉴定一下，提提意见!十分感谢！
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作者: ashey 时间: 2016-10-31 09:41
超速离心的话不应该有经典的茶托样结构吗？坐等大神们来鉴定。
作者: pytruth 时间: 2016-10-31 09:45
我也是这么觉得的，也许跟染色有关？
作者: hzangs 时间: 2016-10-31 10:49
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这是我拍的，利用试剂盒沉淀的样品。 这张图是特地拍了一下 样品里的球状结构。这个可以肯定不是外泌体，具体是什么 还不清楚，可能是血清里的蛋白团聚形成的结晶。
楼主的图中拍到的 基本和这个图里的类似，所以 可能楼主拍到的不是外泌体。
作者: pytruth 时间: 2016-10-31 11:02
还想请教一下：1.第五张或者第六张图是细胞培液提取的，里面感觉有点茶托样结构，你觉得会是吗？
2.我没有用戊二醛什么的固定，直接负染，会不会跟染色有关系？
3.我是按照Thery.C文献的流程超离提取的，超离提取细胞培液和血清后里面也会有大量杂蛋白吗？
作者: hzangs 时间: 2016-10-31 12:41
给您图片的右下角打了号码。6号图的结构明显不是外泌体，可能是抱团的蛋白。7号图的结构明显直径过大。8号图结构不清晰，看上去不是很像。9号图结构直径过大。
我之前拍的电镜图 都不用戊二醛固定。 直接使用铀盐负染后放置十几分钟 就上机，不会有影响。
thery的方法 分离血清中的外泌体还是需要事先稀释血清的，杂蛋白是有的，量不大。
作者: pytruth 时间: 2016-10-31 20:34
谢谢版主！血清我是稀释后超离的，2ml稀释到了12ml，超离前还过了0.22um滤膜。版主的意思是我的图里照的是蛋白的可能性比较大？我的电镜图中间只能看到这样的一些类似蛋白的小点，看不到类似囊泡的结构，会不会是我提取中间有问题？我按照Thery文献当中说的是要在第一次100000g离心后直接倒掉离心管中上清液，第二次100000g离心之后也要倒干净离心管中的上清液再用100ulpbs冲洗，不知道这两步中倒出上清液会不会对exosome得率有影响？
作者: hzangs 时间: 2016-11-1 10:14
本帖最后由 hzangs 于 2016-11-1 10:16 编辑
不要倒…… 要吸……
要吸掉上清…… 倒的话 真的会倒掉很多沉淀的
还有 一般血清稀释10-20倍。 你可以把2ml稀释到20-30ml 我们一般是0.5mL稀释到12ml
作者: pytruth 时间: 2016-11-1 14:52
好的，谢谢，超离完两次都要用枪吸吧？第二次超离完要吸的干净一点再加入pbs溶解？我第一次超离完好像还能看到点沉淀，第二次就看不到了，可以只超离一次吗？还想问一下，超离前用0.22um滤膜过滤会不会导致外泌体得率降低？
作者: hzangs 时间: 2016-11-1 17:51
第一次不要吸太干净。 你很可能把沉淀给扔掉了…… 所以你第一次能看到沉淀，洗一次就看不到了 o(╯□╰)o。 过0.22滤膜 这个影响 我不知道， 没试过
作者: pytruth 时间: 2016-11-1 21:50
好的。请问用超滤管浓缩细胞培液再超离对外泌体得率有影响吗？我看有的文献超离转速更高，超离时间也长，超离的时间和转速提高一些会不会能提高外泌体得率？
作者: hzangs 时间: 2016-11-2 11:36
浓缩细胞培液后 细胞培液会变粘稠，反而不容易超离得到外泌体。 而提高转速和时间会不会提高得率，我没有试过，但理论上 不会，因为超离已经把所有的外泌体都超下来了，哪里还有外泌体。。。
作者: pytruth 时间: 2016-11-4 15:15
请问师兄有尝试过浓缩了细胞培液之后再超离吗？
是说45ml上清液直接离心要比浓缩后再超离得到的外泌体要更多？
我浓缩完了感觉细胞培液并没有很粘稠，用的是100kd的超滤管，不知道是不是管子用的有问题？
作者: hzangs 时间: 2016-11-4 16:18
100kd的没有尝试过。 你可以试试。 100KD的浓缩可能会好一些，我之前用10KD的浓缩过，浓缩后确实会很粘稠
作者: pytruth 时间: 2016-11-6 15:00
好的，谢谢！
作者: katekitekite 时间: 2016-11-8 16:31
100KD的浓缩可以 可以把很多杂蛋白去掉 所以液体不会变的异常粘稠 我浓缩后用磁珠提纯 量是比较少 不过外泌体还是有的 电镜可以看到 直接样品滴到铜网上 吸附一会 滤纸吸干后 负染色 样品不用固定
作者: katekitekite 时间: 2016-11-8 16:33
版主 你浓缩后 用浓缩液稍微吹洗滤膜了么 感觉BCA测浓度差好多
作者: hzangs 时间: 2016-11-8 19:15
我是要吹洗的
作者: karen 时间: 2016-11-8 19:22
版主好厉害!
作者: katekitekite 时间: 2016-11-8 21:14
那以后我就一直吹洗吧 感觉浓度差了一个级别
作者: pytruth 时间: 2016-11-10 16:49
没有，就是尽量吸干净了，因为我感觉100kd的管子浓缩完还比较稀，下回我也试试
作者: pytruth 时间: 2016-11-10 16:51
刚上手细胞外泌体这块，还是菜鸟，互相学习
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