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标题: 请教关于血浆外泌体提取的问题 [打印本页]
作者: 丫丫    时间: 2016-11-16 09:29
标题: 请教关于血浆外泌体提取的问题
求助：1、请问用血将提取外泌体的话，提取之前血浆放-80保存会对外泌体有影响吗？
           2、如果用超离的方法提取血浆中的外泌体应该用多少体积呢？
           请各位大神赐教！不胜感激！
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2016-11-16 10:35
1. -80保存对外泌体没有太大的影响，注意避免反复冻融
2. It depends on your purpose, a few hundred microliter is enough for WB or RT-PCR detection of microRNA
作者: 丫丫    时间: 2016-11-16 14:54
baishixiaoyaozi 发表于 2016-11-16 10:35
1. -80保存对外泌体没有太大的影响，注意避免反复冻融
2. It depends on your purpose, a few hundred micr ...

好的！十分感谢！
作者: 惘痕    时间: 2017-3-16 22:40
基本没有什么影响，做过对比分析
作者: 八戒在五湖    时间: 2017-3-22 08:08
想问一下血浆是加过抗凝的么，没加过抗凝的血浆可以提外泌体么
作者: 丫丫    时间: 2017-3-24 09:46
八戒在五湖 发表于 2017-3-22 08:08
想问一下血浆是加过抗凝的么，没加过抗凝的血浆可以提外泌体么

根据试剂盒的要求，血浆提外泌体前加了凝血酶素D
作者: 八戒在五湖    时间: 2017-3-27 10:23
丫丫 发表于 2017-3-24 09:46
根据试剂盒的要求，血浆提外泌体前加了凝血酶素D

那就是没加抗凝的血浆也是可以提外泌体的？请问有什么合适的试剂盒可以推荐吗
作者: 丫丫    时间: 2017-3-29 09:53
八戒在五湖 发表于 2017-3-27 10:23
那就是没加抗凝的血浆也是可以提外泌体的？请问有什么合适的试剂盒可以推荐吗 ...

我用的是SBI的，其他的还没用过
作者: 八戒在五湖    时间: 2017-4-23 09:59
提取效果怎么样呀，我的血浆没加抗凝，都凝固了，不知道能不能提
作者: 丫丫    时间: 2017-5-2 17:09
八戒在五湖 发表于 2017-4-23 09:59
提取效果怎么样呀，我的血浆没加抗凝，都凝固了，不知道能不能提

都凝固了还怎么提？我也不知道哎，没遇到过这种情况。用试剂盒提的还可以吧。
作者: 小葱    时间: 2017-7-14 16:55
baishixiaoyaozi 发表于 2016-11-16 10:35
1. -80保存对外泌体没有太大的影响，注意避免反复冻融
2. It depends on your purpose, a few hundred micr ...

您好，针对于这个问题，我想问一下，是否有相关的文章可以参考，可以分享一下么？非常感谢。
作者: 小葱    时间: 2017-7-14 16:57
惘痕 发表于 2017-3-16 22:40
基本没有什么影响，做过对比分析

对比分析的数据是否已发表，可以分享链接么？谢谢
作者: 深呼吸的行者    时间: 2017-8-17 21:40
baishixiaoyaozi 发表于 2016-11-16 10:35
1. -80保存对外泌体没有太大的影响，注意避免反复冻融
2. It depends on your purpose, a few hundred micr ...

前辈你好，我们想提取外泌体RNA进行测序的话有什么办法提高RNA得率吗？
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-8-17 23:21
深呼吸的行者 发表于 2017-8-17 21:40
前辈你好，我们想提取外泌体RNA进行测序的话有什么办法提高RNA得率吗？

增加起始的exosome量，如果用Trizol试剂提取，沉淀时放在-20过夜，同时加入glycogen共沉淀。RNAseq，如果用total RNA大约需要1微克；如果用纯化的small RNA大约需要50-100纳克。
作者: slxiang    时间: 2017-9-5 10:41
baishixiaoyaozi 发表于 2016-11-16 10:35
1. -80保存对外泌体没有太大的影响，注意避免反复冻融
2. It depends on your purpose, a few hundred micr ...

请问肝素钠、EDTA和柠檬酸钠这三种抗凝剂对血浆外泌体的提取有影响么？哪种最合适
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-9-5 21:31
slxiang 发表于 2017-9-5 10:41
请问肝素钠、EDTA和柠檬酸钠这三种抗凝剂对血浆外泌体的提取有影响么？哪种最合适 ...

如果用试剂盒的话，参考使用说明书。
我们实验室用EDTA，然后超速离心收集，对外泌体没有影响（至少用到外泌体的实验目前为止100%能够重复）。
作者: zzycircle    时间: 2017-9-23 20:16
baishixiaoyaozi 发表于 2017-9-5 21:31
如果用试剂盒的话，参考使用说明书。
我们实验室用EDTA，然后超速离心收集，对外泌体没有影响（至少用到 ...

请问可以发一下具体的超离步骤吗？
是否需要0.22的膜滤过一下。谢谢~
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-9-25 20:48
zzycircle 发表于 2017-9-23 20:16
请问可以发一下具体的超离步骤吗？
是否需要0.22的膜滤过一下。谢谢~

全血1000g离心10分钟，取血浆，然后1000g再离心10分钟去除血细胞。血浆用particle-free PBS稀释后离心，10000g离心30分钟去除micro-particles（也有的protocol使用0.22um滤膜去除micro-particles），上清转移至超速离心管，100000g离心2小时。沉淀（基本上看不见）用PBS重悬，NTA检测浓度和直径。
作者: rjshimm    时间: 2017-9-26 09:24
slxiang 发表于 2017-9-5 10:41
请问肝素钠、EDTA和柠檬酸钠这三种抗凝剂对血浆外泌体的提取有影响么？哪种最合适 ...

肝素抗凝会对后续PCR产生影响。若后续试验涉及PCR，不能使用肝素作为抗凝剂。
作者: rjshimm    时间: 2017-9-26 09:27
八戒在五湖 发表于 2017-4-23 09:59
提取效果怎么样呀，我的血浆没加抗凝，都凝固了，不知道能不能提

没加抗凝剂，待血液凝固后离心得到的上清是血清。
加了抗凝剂，自然分层后离心得到的上清叫血浆。
两者都可以提取外泌体的吧。我是用qiagen试剂盒直接提取的外泌体总RNA，血清血浆都可以。
作者: zzycircle    时间: 2017-9-26 22:24
baishixiaoyaozi 发表于 2017-9-25 20:48
全血1000g离心10分钟，取血浆，然后1000g再离心10分钟去除血细胞。血浆用particle-free PBS稀释后离心，1 ...

谢谢啦  可以再问一下PBS稀释比例吗
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-9-27 21:26
zzycircle 发表于 2017-9-26 22:24
谢谢啦  可以再问一下PBS稀释比例吗

我是按照所用的超速离心管大小来稀释的。我用5毫升的离心管，加1毫升plasma，用4毫升PBS稀释（最少用2.5毫升PBS，超速离心样品体积不能少于离心管最大体积的70%）
作者: zzycircle    时间: 2017-10-29 21:55
baishixiaoyaozi 发表于 2017-9-27 21:26
我是按照所用的超速离心管大小来稀释的。我用5毫升的离心管，加1毫升plasma，用4毫升PBS稀释（最少用2.5 ...

好的谢谢啦  我用的5ml pbs稀释300u的
作者: 深呼吸的行者    时间: 2017-10-31 09:46
baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-17 23:21
增加起始的exosome量，如果用Trizol试剂提取，沉淀时放在-20过夜，同时加入glycogen共沉淀。RNAseq，如果 ...

谢谢前辈回答。那么glycogen应该加多少呢？
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-10-31 23:53
深呼吸的行者 发表于 2017-10-31 09:46
谢谢前辈回答。那么glycogen应该加多少呢？

我一般加15-20微克，离心后就能看到沉淀。
作者: liyanyan    时间: 2017-12-6 09:53
丫丫 发表于 2017-3-29 09:53
我用的是SBI的，其他的还没用过

请问提取的质量如何？
作者: 快乐的人    时间: 2018-7-25 21:04
丫丫 发表于 2016-11-16 14:54
好的！十分感谢！

请问一下为什么离心前要用PBS稀释血浆，不稀释可以吗？
作者: 快乐的人    时间: 2018-7-28 09:57
baishixiaoyaozi 发表于 2017-9-5 21:31
如果用试剂盒的话，参考使用说明书。
我们实验室用EDTA，然后超速离心收集，对外泌体没有影响（至少用到 ...

用EDTA抗凝  配方的比例是多少呀
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2018-7-31 04:16
快乐的人 发表于 2018-7-28 09:57
用EDTA抗凝  配方的比例是多少呀

http://www.bd.com/en-us/offering ... -faq/edta-tubes-faq
作者: 快乐的人    时间: 2019-3-22 10:56
baishixiaoyaozi 发表于 2018-7-31 04:16
http://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/specimen-collection/blood-collection/venous-collect ...

请问一下提取血浆中的miRNA 需要什么试剂盒
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2019-3-22 22:27
快乐的人 发表于 2019-3-22 10:56
请问一下提取血浆中的miRNA 需要什么试剂盒

mirVana: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1560
miRNeasy: https://www.qiagen.com/us/shop/s ... orderinginformation

暂时想到这两个
作者: CheungKL    时间: 2019-10-7 21:43
baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-17 23:21
增加起始的exosome量，如果用Trizol试剂提取，沉淀时放在-20过夜，同时加入glycogen共沉淀。RNAseq，如果 ...

老师你好，我想问下你提取RNA的protocol可以发一下吗？还有glycogen你用的是哪个公司的？
太感谢了！
作者: sunluyao014488    时间: 2020-6-7 12:46
丫丫 发表于 2017-3-29 09:53
我用的是SBI的，其他的还没用过

您好，想请问一下您用的SBI试剂盒提取血浆外泌体，可以分享一下SBI哪一款试剂盒吗？货号之类的呢？谢谢，万分感激
作者: future1994    时间: 2020-12-3 19:01
baishixiaoyaozi 发表于 2017-9-25 20:48
全血1000g离心10分钟，取血浆，然后1000g再离心10分钟去除血细胞。血浆用particle-free PBS稀释后离心，1 ...

您好老师，超速离心完基本看不到沉淀，您是直接把所有上清都吸掉吗，还是会留点
作者: lililala6868    时间: 2021-1-4 18:53
全血1000g离心10分钟，取血浆，台湾威力彩然后1000g再离心10分钟去除血细胞。血浆用particle-free PBS稀释后离心，体彩排列5离心30分钟去除micro-particles（也有的protocol使用0.22um滤膜去除micro-particles
   





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