外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 外泌体蛋白浓度问题 [打印本页]

---

作者: 我是小白    时间: 2016-12-8 21:32
标题: 外泌体蛋白浓度问题
用超速离心法提取血清中外泌体后，pbs重悬。在测蛋白和蛋白变性的过程中需要加入裂解液吗？目前我自己一直未加裂解液，向加过裂解液的同志学习一下经验.

---

作者: baishixiaoyaozi    时间: 2016-12-9 09:52
如果准备做western，弃去上清后，我直接用加入RIPA裂解液，冰上裂解10分钟后，BCA法测浓度。

---

作者: 我是小白    时间: 2016-12-9 11:04

baishixiaoyaozi 发表于 2016-12-9 09:52
如果准备做western，弃去上清后，我直接用加入RIPA裂解液，冰上裂解10分钟后，BCA法测浓度。 ...

可是还涉及到外泌体保存问题。

---

作者: baishixiaoyaozi    时间: 2016-12-9 22:46
I got. 如果后续实验需要完整外泌体，我们实验室用NTA测浓度，还有人PBS重悬后取一点直接BCA法测蛋白浓度。

---

作者: 鱼儿    时间: 2016-12-15 22:23
谢谢楼主

---

作者: 鱼儿    时间: 2016-12-15 22:29
学习一下，楼主，谢谢

---

作者: xiaoruan    时间: 2018-1-9 12:10

baishixiaoyaozi 发表于 2016-12-9 09:52
如果准备做western，弃去上清后，我直接用加入RIPA裂解液，冰上裂解10分钟后，BCA法测浓度。 ...

亲，你的浓度测来是多少呀，用的什么样本，量是多少呀

---

作者: baishixiaoyaozi    时间: 2018-1-9 23:08

xiaoruan 发表于 2018-1-9 12:10
亲，你的浓度测来是多少呀，用的什么样本，量是多少呀

大鼠原代胶质细胞来源的外泌体，100ml无血清培养基，24小时后超离收集外泌体。50微升RIPA重悬，BCA定蛋白量，浓度一般0.4-0.5微克/微升。Western，load10微克蛋白。

---

作者: ronaldchen    时间: 2018-1-12 14:45

baishixiaoyaozi 发表于 2018-1-9 23:08
大鼠原代胶质细胞来源的外泌体，100ml无血清培养基，24小时后超离收集外泌体。50微升RIPA重悬，BCA定蛋白 ...

请问你做的marker是？ CD63好做么？

---

作者: baishixiaoyaozi    时间: 2018-1-13 00:03

ronaldchen 发表于 2018-1-12 14:45
请问你做的marker是？ CD63好做么？

CD63, flotilin, tsg101
CD63用的是Santa Cruz的抗体，还可以。Smear大小在50-70Kda之间

---

作者: ronaldchen    时间: 2018-1-13 23:12

baishixiaoyaozi 发表于 2018-1-13 00:03
CD63, flotilin, tsg101
CD63用的是Santa Cruz的抗体，还可以。Smear大小在50-70Kda之间 ...

我没做出来，不知道是不是吸的时候把外泌体弄丢了...

---

作者: baishixiaoyaozi    时间: 2018-1-15 01:57

ronaldchen 发表于 2018-1-13 23:12
我没做出来，不知道是不是吸的时候把外泌体弄丢了...

弃上清这一步确实要小心，慢慢操作。
你是所有marker都没做出来，还是只有CD63没做出来？

---

作者: ronaldchen    时间: 2018-1-15 14:10
CD63，其他的marker还没有到货，CD63用的和你一样的抗体。
我在想可能是吸的时候，很难避免吸掉了。是不是倒好些？我用的水平转头。
或者说用真空泵吸

---

作者: ronaldchen    时间: 2018-1-15 19:38

baishixiaoyaozi 发表于 2018-1-15 01:57
弃上清这一步确实要小心，慢慢操作。
你是所有marker都没做出来，还是只有CD63没做出来？ ...

刚做出来了CD63,   吸的时候留了很多上清，才做出来的。
这样外泌确保在，不过上清留得太大，杂蛋白也太多。
不知道您是怎么弃上清的呢？是吸还是倒呢？还是会留一点？

---

作者: DBLB    时间: 2019-10-11 19:14

baishixiaoyaozi 发表于 2016-12-9 09:52
如果准备做western，弃去上清后，我直接用加入RIPA裂解液，冰上裂解10分钟后，BCA法测浓度。 ...

您好，请问一下您用的是哪一种RIPA裂解液，BCA测出来浓度大概是多少，有没有试过超声的方法来裂解

---

作者: zhangchao    时间: 2020-7-19 22:59

baishixiaoyaozi 发表于 2018-1-9 23:08
大鼠原代胶质细胞来源的外泌体，100ml无血清培养基，24小时后超离收集外泌体。50微升RIPA重悬，BCA定蛋白 ...

请问只加RIPA裂解液么，不加其他的抑制剂什么的么？ 50ulRIPA和待测的外泌体是多少比例呀？

---

作者: WinterBlinder    时间: 2021-5-16 20:40
学习学习

---

欢迎光临 外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用 (http://exosome.com.cn/)

Powered by Discuz! X3.3