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标题: 超滤浓缩加超速离心提取外泌体遇到问题，求大神指导 [打印本页]
作者: pytruth    时间: 2016-12-23 20:54
标题: 超滤浓缩加超速离心提取外泌体遇到问题，求大神指导
请问有大神用过超滤管浓缩细胞上清液之后再超速离心提取吗？我先按照300g、2000g、10000g离心完之后过0.22um滤膜，之后用3kd和100kd两种超滤管试试浓缩65ml上清液至12ml左右，怕外泌体挂在超滤管的膜上，特意用上清液冲洗了几次后，再100000g70min离心一次pbs洗一次再100000g70min离心，之后BCA测蛋白才0.8ug/ul，WB标记蛋白条带几乎没有，不知道是什么原因。作为对照，我在离上清液的同时，还同时超离了血清作为对照，血清除了没有用超滤管浓缩外，其他步骤均相同，蛋白量得有10ug/ul，而且WB跑了标记蛋白也出条带了，这是怎么回事呢？
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2016-12-24 04:56
我先超速离心，重悬后，荧光染料标记，再用100K超滤管去除游离染料，回收效率挺高。
你之前试过直接超离收集外泌体吗？蛋白浓度如何？
作者: tylz1985    时间: 2016-12-24 09:44
大神，我一直不明白100k超滤管的原理，是大于100kd的可以被去除？但为什么小分子反而不能被离心下去呢？
作者: pytruth    时间: 2016-12-24 10:56
baishixiaoyaozi 发表于 2016-12-24 04:56
我先超速离心，重悬后，荧光染料标记，再用100K超滤管去除游离染料，回收效率挺高。
你之前试过直接超离收 ...

你是用100KD的管子去除游离染料?游离染料肯定是小分子，比100KD的蛋白都小多了。我试过直接超速离心，因为实验室只有11.2，ml的超离管，所以直接11.2ml超离细胞上清肯定是没有东西的，我就用1ml血清PBS稀释到11.2ml跟浓缩过的细胞上清液一起超离作为对照，蛋白浓度很高10ug/ul，WB也有maker。
作者: pytruth    时间: 2016-12-24 11:00
tylz1985 发表于 2016-12-24 09:44
大神，我一直不明白100k超滤管的原理，是大于100kd的可以被去除？但为什么小分子反而不能被离心下去呢？ ...

100KD就是指的100KD大小的蛋白，小于100KD的蛋白大部分会在超滤管离心时跑到超滤膜的外侧，超滤膜内侧就是小于100KD的蛋白。也可以这么说，超滤膜的孔径是6um，膜内侧是大于6um的东西，膜外侧是小于6um的东西
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2016-12-24 22:26
pytruth 发表于 2016-12-24 10:56
你是用100KD的管子去除游离染料?游离染料肯定是小分子，比100KD的蛋白都小多了。我试过直接超速离心，因 ...

转子一次最多能超离多少培养基？离心后一起裂解。
血清里除了外泌体，还有很多血清蛋白，超离后会黏在管壁上，所以浓度比较高。
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2016-12-24 22:29
pytruth 发表于 2016-12-24 11:00
100KD就是指的100KD大小的蛋白，小于100KD的蛋白大部分会在超滤管离心时跑到超滤膜的外侧，超滤膜内侧就 ...

孔径没这么大，300K截留超滤膜的孔径大概在40-50nm。
作者: pytruth    时间: 2016-12-25 14:12
baishixiaoyaozi 发表于 2016-12-24 22:26
转子一次最多能超离多少培养基？离心后一起裂解。
血清里除了外泌体，还有很多血清蛋白，超离后会黏在管 ...

转子一次可以离八个管，每管11.2ml。血清里确实各种蛋白比较多，所以提出来的东西我跑了外泌体标记蛋白蛋白，确定我提到的是外泌体。
作者: pytruth    时间: 2016-12-25 14:13
baishixiaoyaozi 发表于 2016-12-24 22:29
孔径没这么大，300K截留超滤膜的孔径大概在40-50nm。

你说的是millipo的100KD的管子吗？我问的是millipo的技术服务，他们告诉我的，说是100kd孔径大约6nm
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2016-12-26 02:34
pytruth 发表于 2016-12-25 14:12
转子一次可以离八个管，每管11.2ml。血清里确实各种蛋白比较多，所以提出来的东西我跑了外泌体标记蛋白蛋 ...

8管，每管11mL，不算少了。超离后每管加1mL PBS清洗，然后合并再离心，最后加适量裂解液。我们实验室用的是30mL离心管，转子一次4个管子。
作者: pytruth    时间: 2016-12-26 12:35
baishixiaoyaozi 发表于 2016-12-26 02:34
8管，每管11mL，不算少了。超离后每管加1mL PBS清洗，然后合并再离心，最后加适量裂解液。我们实验室用的 ...

11ml看不见沉淀，怎么冲呢？你是什么细胞？你试过离11ml吗，能看见沉淀吗？30ml离心能看见沉淀吗？
作者: tylz1985    时间: 2016-12-26 13:06
baishixiaoyaozi 发表于 2016-12-26 02:34
8管，每管11mL，不算少了。超离后每管加1mL PBS清洗，然后合并再离心，最后加适量裂解液。我们实验室用的 ...

这样提取的外泌体应该包含了很多杂质蛋白，是吗？
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2016-12-27 02:56
pytruth 发表于 2016-12-26 12:35
11ml看不见沉淀，怎么冲呢？你是什么细胞？你试过离11ml吗，能看见沉淀吗？30ml离心能看见沉淀吗？ ...

我用120ml超离，看不见沉淀，第一次离心后，每管加5ml PBS重悬，合并后再离心，最后加裂解液。可以检测到exosomal markers。
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2016-12-27 02:58
tylz1985 发表于 2016-12-26 13:06
这样提取的外泌体应该包含了很多杂质蛋白，是吗？

如果用含血清的培养基，可能包含杂蛋白比如serum albumin。无血清培养基会好很多。



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