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标题: 关于Exo的WB检测 [打印本页]

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作者: luckkit    时间: 2015-3-31 11:31
标题: 关于Exo的WB检测
急问，做Exo的WB检测前，Exo沉淀到底是该有RIPA裂解还是直接用PBS重悬？以前制备的Exo都是用PBS重悬的，600ng/ul左右，如果再加RIPA，是否蛋白浓度太低，能否直接加loading buffer煮沸，再超声，就上样跑胶？谢谢！

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作者: songkai900818    时间: 2015-3-31 21:00
可以用PBS先洗一下，然后再加RIPA裂解，一般沉淀不会轻易被洗掉

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作者: luckkit    时间: 2015-4-1 13:12
谢谢楼上诸位，直接加4x  loading buffer 95度10min，冻回-80度，明天上样跑WB

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作者: luckkit    时间: 2015-4-3 12:44
上样20ug,WB曝光，效果不理想，CD9,TSG101,GRP94, abcam兔源单抗，1/1000,二抗1/5000，其中TSG101（曝光120s）很弱，GRP94总蛋白（曝光120s）出现条带，但EXO也有弱带，难道标准差异超离所得产物不纯？而CD9完全无带，直接孵鼠源抗CD81过夜（未stripe），明天再看。

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作者: luckkit    时间: 2015-4-3 12:47
如果效果还不理想，就准备最多上50ug,另外改用RIPA重悬pellet,提高抗体浓度，或改用胶片曝光，目前只能够想到这些，请大家多建议，谢谢

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作者: luckkit    时间: 2015-4-3 21:59

Johnny 发表于 2015-4-3 03:34
你离心的步骤具体是怎么样的？

CD9没有条带应该是正常的，感觉不是所有的细胞分泌的exosome都有CD9。

按照wiley protocol来的，CD9关键是提取的细胞总蛋白也没有曝光出来。
谢谢！

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作者: fengshilou    时间: 2015-4-21 20:44
我们的也没有出来

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作者: kuguaquhuo    时间: 2015-5-7 22:01

luckkit 发表于 2015-4-3 12:44
上样20ug,WB曝光，效果不理想，CD9,TSG101,GRP94, abcam兔源单抗，1/1000,二抗1/5000，其中TSG101（曝光120 ...

弱弱问下，你提EXO做WB，统一上样量后，岂不是所含exo量相同，那exo上的标志蛋白的量不就也相同了，刚接触，求解答，我想做WB表明exo的量。

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作者: luckkit    时间: 2015-5-8 03:53
标题: ,


不同组织或细胞来源的Exo其标志蛋白含量不尽相同,WB似乎不能用于Exo定量，用NTA系统吧

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作者: yy8651    时间: 2015-5-8 09:14
WB的意义是什么呢？

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作者: G2SNOW    时间: 2015-5-23 15:49

Johnny 发表于 2015-3-31 21:04
可直接加1X loading buffer 95度5-10min，然后上样跑WB

版主是指离心底部直接用loading buffer 收集沉淀吗？但是这样不是没法测浓度了吗？

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作者: kadak007    时间: 2015-5-27 10:59

Johnny 发表于 2015-5-23 19:17
对 不测浓度

跑western前，很多人会常规测下浓度，请教下，意义何在呢？

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作者: yy8651    时间: 2015-5-27 11:29
有没有好心人能提供下WB的详细方法

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作者: vipivy    时间: 2016-8-1 21:58
求外泌体提取后WB的详细方法，本人菜鸟一枚。十分感谢!

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作者: 泌外何教授    时间: 2016-10-7 16:35

Johnny 发表于 2015-4-3 17:34
你离心的步骤具体是怎么样的？

CD9没有条带应该是正常的，感觉不是所有的细胞分泌的exosome都有CD9。

从exocarta中能查到我所需要的细胞能表达哪些蛋白吗

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作者: dancing    时间: 2016-10-8 12:25

songkai900818 发表于 2015-3-31 21:00
可以用PBS先洗一下，然后再加RIPA裂解，一般沉淀不会轻易被洗掉

加ripa裂解的时候是直接涡旋就行吗，然后就可以加loading buffer或者冷冻保存，还是还有别的步骤

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作者: 泌外何教授    时间: 2016-10-12 10:34

Johnny 发表于 2016-10-8 13:04
貌似不能

好的，十分感谢

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作者: sonja_forever    时间: 2016-12-13 14:01

Johnny 发表于 2015-5-23 19:17
对 不测浓度

不测浓度，就也不用保证跟对照的细胞总蛋白上样量一致是吗？所以也不用设内参是吗？

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作者: cxx123    时间: 2023-6-27 15:32

luckkit 发表于 2015-4-1 13:12
谢谢楼上诸位，直接加4x  loading buffer 95度10min，冻回-80度，明天上样跑WB

直接加4x  loading buffer，不加裂解液吗？

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