外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 超速离心后,PBS洗多少次比较合适? [打印本页]

作者: 北燕南飞    时间: 2017-4-18 16:19
标题: 超速离心后,PBS洗多少次比较合适?
采用经典protocol方法(PBS清洗一次)对细胞培养液中外泌体进行提取时,电镜做出来背景非常脏
大家一般清洗几次,多次清洗会不会导致外泌体破裂?

作者: hzangs    时间: 2017-4-18 16:59
这个可能和细胞系本身有关,也跟你使用的染料有关。脏东西可能是染料里的。  我是洗一次到两次   一般一次
作者: 北燕南飞    时间: 2017-4-18 17:01
本帖最后由 北燕南飞 于 2017-4-20 14:56 编辑
hzangs 发表于 2017-4-18 16:59
这个可能和细胞系本身有关,也跟你使用的染料有关。脏东西可能是染料里的。  我是洗一次到两次   一般一次 ...

有道理
作者: 八戒在五湖    时间: 2017-4-23 10:01
楼主,我想问一下你提外泌体的protocol···
作者: 北燕南飞    时间: 2017-4-24 14:54
八戒在五湖 发表于 2017-4-23 10:01
楼主,我想问一下你提外泌体的protocol···

300g 10min,取上清;2,000g 10min,取上清; 10,000g 30min,取上清; 100,000g 70 min,取沉淀;加PBS清洗, 100,000g 70 min
作者: 八戒在五湖    时间: 2017-4-24 15:59
北燕南飞 发表于 2017-4-24 14:54
300g 10min,取上清;2,000g 10min,取上清; 10,000g 30min,取上清; 100,000g 70 min,取沉淀;加PBS ...

康萨米达~
作者: afra    时间: 2017-5-9 16:58
hzangs 发表于 2017-4-18 16:59
这个可能和细胞系本身有关,也跟你使用的染料有关。脏东西可能是染料里的。  我是洗一次到两次   一般一次 ...

请问一下您超离后能看到沉淀吗
作者: hzangs    时间: 2017-5-9 17:49
afra 发表于 2017-5-9 16:58
请问一下您超离后能看到沉淀吗

可以的。 非常少  非常小的沉淀。 不容易发现
作者: 步步唧唧    时间: 2017-5-9 19:31
hzangs 发表于 2017-5-9 17:49
可以的。 非常少  非常小的沉淀。 不容易发现

问一下每次提取要多少癌细胞上清?我一般用30--40ml,最后提出来也就一点儿,200ul重悬,觉得量太少,实验室离心机转子配套管子太小了。
作者: 弹珠1253    时间: 2017-5-10 21:42
小白请指教~请问下是否需要0.22 um微孔滤膜过滤呢?需要的话在第几步比较合适呢?
作者: 北燕南飞    时间: 2017-5-15 20:53
弹珠1253 发表于 2017-5-10 21:42
小白请指教~请问下是否需要0.22 um微孔滤膜过滤呢?需要的话在第几步比较合适呢? ...

我之前没有滤过,不过如果需要滤的话,应该在超离前
作者: 弹珠1253    时间: 2017-5-15 20:59
北燕南飞 发表于 2017-5-15 20:53
我之前没有滤过,不过如果需要滤的话,应该在超离前

好的感谢!看到一个protocol就是在12000之后超离之前过滤,就按那个做了
作者: meiling    时间: 2017-6-20 11:05
步步唧唧 发表于 2017-5-9 19:31
问一下每次提取要多少癌细胞上清?我一般用30--40ml,最后提出来也就一点儿,200ul重悬,觉得量太少,实 ...

能不能把细胞培养上清取出来,先放-20度冰箱,多积累一些再用呢?

作者: meiling    时间: 2017-6-20 11:10
hzangs 发表于 2017-5-9 17:49
可以的。 非常少  非常小的沉淀。 不容易发现

那请问你用PBS清洗的话,如果沉淀很少,看不到的话,如何操作才能不把沉淀吸走?求技巧
作者: meiling    时间: 2017-6-20 11:13
请问你是送公司做电镜的吗?哪个公司?价格是多少呀?

作者: hzangs    时间: 2017-6-20 13:07
meiling 发表于 2017-6-20 11:10
那请问你用PBS清洗的话,如果沉淀很少,看不到的话,如何操作才能不把沉淀吸走?求技巧 ...

底部留一点液体   不吸走。  PBS洗后 用底部剩余的PBS 重悬
作者: 步步唧唧    时间: 2017-6-20 14:56
meiling 发表于 2017-6-20 11:05
能不能把细胞培养上清取出来,先放-20度冰箱,多积累一些再用呢?

不知道哎!-20没试过。4度倒是试过 还可以提出来
作者: meiling    时间: 2017-6-20 16:20
北燕南飞 发表于 2017-4-24 14:54
300g 10min,取上清;2,000g 10min,取上清; 10,000g 30min,取上清; 100,000g 70 min,取沉淀;加PBS ...

请问300g离心十分钟这一步可以省吗?因为离心后也看不到沉淀
作者: 栾珍珠    时间: 2017-6-22 16:08
步步唧唧 发表于 2017-5-9 19:31
问一下每次提取要多少癌细胞上清?我一般用30--40ml,最后提出来也就一点儿,200ul重悬,觉得量太少,实 ...

同问啊!!!!!!!!!!
作者: 栾珍珠    时间: 2017-6-22 16:10
hzangs 发表于 2017-6-20 13:07
底部留一点液体   不吸走。  PBS洗后 用底部剩余的PBS 重悬

亲,离心后重悬的pbs量太少,实验室超离的管子根本不配套,请问你是怎么做的呀?




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