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标题: 细胞外膜泡研究方法指南 [打印本页]
作者: 土豆 时间: 2017-5-23 18:51
标题: 细胞外膜泡研究方法指南
http://www.exosomemed.com/3012.html
所有体液都含有细胞衍生的膜结构囊泡。这种囊泡由原核生物和真核细胞分泌出来，并含有对环境反应的信息。研究认为细胞衍生的囊泡有助于体内平衡、疾病发展和进展，可以提供新的生物标志物，并且可能适合用作治疗性药物载体。
由于这些胞外囊泡（EV）与生理和病理状况之间的关系，人们对EV的兴趣呈指数增长。 EVs对新型诊断和临床转化有很大希望。阿姆斯特丹大学的研究人员提供了关于研究EVs方法的最新进展的专业更新，并总结了目前接受的注意事项和建议，从样本收集到EVs的分离、检测和表征。突出了常见的误解和方法上的错误。 尽管在所有体液中都发现了EVs，但他们专注于人类血液中的EVs，不仅是最复杂的，也是心血管研究中最有趣的体液。
细胞外囊泡（EV）的样品收集和分离影响后续下游分析的结果（黑色大箭头）。在设计样品采集和分离（灰色小箭头）时，必须考虑预期下游分析的要求。该综述针对每一步都有详细的操作步骤和注意事项，大家可以好好研读一下这篇综述。下面选取血液样本收集部分详解给大家。
血液样品收集
常规实验室血液采集用于EV研究的一般性建议。对于收集血液的受试者，如年龄、昼夜周期和性别等变量需要考虑，但实际上可行时隔夜禁食优先。血浆通常是EV的首选来源，因为额外的EV会在制备血清时的凝块形成期间被释放。目前，血清的主要应用是研究小RNA，如微RNA（miRNA）。
为了制备EVs，血液需要抗凝。已经使用几种抗凝剂来收集血液用于EVs的分析，包括EDTA、氟化钠/草酸钾（NaF / KOx）或柠檬酸三钠。目前，柠檬酸盐（0.109 mol/L终浓度） 是国际上最常用的抗凝血剂，已被国际血栓和止血学会推荐。柠檬酸柠檬酸葡萄糖和柠檬酸盐、茶碱、腺苷和双嘧达莫均能预防血小板活化和血小板EVs比柠檬酸盐更有效释放。抗凝剂的选择主要取决于下游分析，例如EDTA是用于RNA分析的合适的抗凝剂，而肝素干扰聚合酶链反应（PCR）。总之，抑制收集血样中的EV释放，选择抗凝血剂时应考虑预期的下游实验要求。
注意事项和建议
- 从夜间禁食的受试者中收集血液
- 抗凝剂的选择取决于下游的分析
- 避免长时间使用止血器，使用大直径，21米的针
- 使用专业塑料血液收集管收集血样，丢弃前2-3毫升，并在室温下收集血液
- 适当填充管子，以获得适当的抗凝血比例，并轻轻混合
- 在运输过程中保持血液收集管道处于垂直位置
- 血液收集和准备血浆的第一个离心步骤之间的时间间隔应该尽量减少，或者至少在样本之间保持恒定，以限制对浓度和功能活动的影响
- 最好不要在溶血样品中测量EV的尺寸。如果将溶血样本包括在内，则应做出说明，并应测定其溶血程度
细胞外膜泡的分离
不同的生物物理和生物化学性质可用于分离EV，包括大小、质量密度、形状、电荷和抗原表位。最常见的EVs分离方法的原理如下图所示。下表提供了这些方法的比较，包括每种方法的优点和局限性。有分离方法都会影响EV的浓度和纯度，一些方法可能仅用于分离EV，有些方法可以组合起来。
分离细胞外囊泡（EVs）的常用方法的工作原理。分离是基于大小、密度和免疫表型的。A：在差速离心中，分离基于尺寸，较大的EVs（灰色）较早收集在管底部，而较小的EVs（绿色）需更大的离心力才能沉淀。可溶性组分不受离心影响，但是非EV颗粒如脂蛋白和蛋白质聚集体可能与EV一同沉淀下来。B，在密度梯度离心中，分离基于密度，并且EV将移动到其平衡密度。由于密度或相互作用相似，非EV颗粒如脂蛋白可与EV共同作用。相对于梯度具有高密度的可溶性组分将在管的底部收集。C，尺寸排阻色谱法使用大小分离的多孔基质（虚线圆圈）。可溶性组分和小于尺寸阻截值的颗粒暂时进入多孔基质，而大于阻截尺寸的EV和颗粒不会进入多孔基质。EVs和颗粒大于截止值时，可溶性组分和颗粒小于尺寸截止值。D，在超滤中，可溶性蛋白质和小于阻截值（≈105kDa）的颗粒被推过滤器，并且在过滤器处收集EV。E，在免疫捕获试验中，基于其免疫表型捕获EV。使用针对暴露在目标（绿色）EV上的抗原的单克隆抗体（mAb）捕获EV。F，沉淀时，加入沉淀剂可引起EV，非EV颗粒和可溶性蛋白质的聚集。团块会沉淀，离心加速沉淀。
注意事项和建议
- 分离是任何EV测量结果的关键决定因素；在可能的情况下，分离或纯化方法对EV的尺寸、完整性、形态、恢复、浓度和功能性能可能会产生影响
- 最后的产品应该以EV的存在为特征，例如，通过电子显微镜。
- 通过测量ApoB100、ApoA1和ApoB48，可以对非EV的低密度脂蛋白、HDL和chylomicron进行量化
- 为了量化分离效率，3×10^10 EVs每克蛋白质的比值或更大被认为是高纯度。然而，估计的EV的浓度取决于检测方法的依赖程度
想知道细胞外膜泡提取前血浆、血清的准备；细胞培养液收集、存储；各种细胞外膜泡分离方法；颗粒分析、电镜、流式等检测方法；细胞外膜泡成分（RNA\DNA\蛋白质等）分析、功能实验（Functional Assays）等各方面的注意事项和建议去下载文献细看吧。
关于EV的组成和功能的研究提供了EV在健康和疾病中的作用的见解。 在得出结论之前，组件是真正的EV货物，必须考虑到非EV部件的存在。 随着EV分离最近的改进，相信我们可以取得重大进展。功能测定提供了对EV的推定功能的了解，并且这种测定可能在临床上是有用的。然而，目前还没有国际标准，没有标准化，这种测定结果的相关性和可比性仍然不够清楚。总而言之，衡量EV的组成和功能部分的研究工作正在进行中，迄今为止发现的缺点将在不久的将来克服。
参考文献：
Coumans FAW, Brisson AR, Buzas EI, Dignat-George F, Drees EEE, El-Andaloussi S, Emanueli C, Gasecka A, Hendrix A, Hill AF, Lacroix R, Lee Y, van Leeuwen TG, Mackman N, Mäger I, Nolan JP, van der Pol E, Pegtel DM, Sahoo S, Siljander PRM, Sturk G, de Wever O, Nieuwland R. (2017)Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles. Circ Res 120(10):1632-1648. IF=11.551
作者: 大鹏子 时间: 2017-5-24 11:18
谢谢分享
作者: afra 时间: 2017-5-26 14:07
请问一下，-80冻存的血浆用来提取exosome您是冰上解冻还是37度解冻？
作者: 18940258208 时间: 2017-5-30 18:38
新人报道，学习了
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