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标题: 关于细胞培养上清中提取外泌体的相关问题 [打印本页]
作者: lczyld    时间: 2017-8-1 15:23
标题: 关于细胞培养上清中提取外泌体的相关问题
我培养的是细胞系，准备从培养上清中提取外泌体，有做过相关实验的前辈么。1、大概至少得多少上清，才能理想地提取外泌体？
2、换用无外泌体血清的时机和培养时间
3、用的是培养皿还是培养板
如有相关经验的，希望能给予指导，一起交流交流，十分感谢！


作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或google scholar找一找，是否有人用过一样的细胞系，他们的实验步骤是怎么样的。比如我之前养原代细胞，用T150培养瓶，每次做实验需要8-10个T150 flask （80% confluency），用无血清培养基（没钱买exo-free FBS），培养24小时，收集上清（~120毫升），差数离心后再超离。200微升重悬exosome，终浓度大约10^8/mL。
作者: lczyld    时间: 2017-8-2 07:59
baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或g ...

谢谢前辈的热心回答！请问您的120ml上清直接拿去超离么，看到文献里有浓缩这一步，不知道怎么做到的。因为我买了ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution (System Biosciences)，推荐是5毫升上清加1毫升试剂，所以上清不能太多了，试剂盒总共就5毫升。
作者: tshenbin    时间: 2017-8-2 21:57
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作者: lczyld    时间: 2017-8-6 21:06
tshenbin 发表于 2017-8-2 21:57
建议你用Amicon Ultra-15 100K NMWL进行超滤浓缩，这样可以减少上清体积。

好的，十分感谢您的建议！我试试
作者: lczyld    时间: 2017-8-12 16:24
tshenbin 发表于 2017-8-2 21:57
建议你用Amicon Ultra-15 100K NMWL进行超滤浓缩，这样可以减少上清体积。

前辈，离心时间和离心力多少最合适？
作者: jinzc0228    时间: 2017-8-13 18:30
baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或g ...

请问您是120ML上清总共得到200微升的外泌体，还是每个超离管底部最后的沉淀用200微升重悬
作者: qyjinghui    时间: 2017-8-22 13:44
baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或g ...

老师您好，想跟您咨询一个问题。我们打算用药物处理脐带间充质干细胞，然后对比处理后和处理前外泌体内容物miRNA的差异。我们对P3代的细胞进行处理，在70％汇合度的时候加药处理2天，这时候细胞已经长满了，先不传代，我再用不含血清的培养基继续进行饥饿培养，48h后收集上清进行超离。还是加药处理2天等细胞长满了，传代之后再用不含血清的培养基饥饿培养，在收集上清进行超离呢？谢谢您的回答。
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-8-22 21:01
qyjinghui 发表于 2017-8-22 13:44
老师您好，想跟您咨询一个问题。我们打算用药物处理脐带间充质干细胞，然后对比处理后和处理前外泌体内容 ...

我的建议是药物处理之后马上换无血清培养基收集细胞外泌体，因为传代之后细胞状态会发生变化，此时收集的外泌体中miRNA种类和数量若发生变化，原因可能会同时来自药物处理以及传代导致的细胞状态变化。
祝实验顺利！

不用叫我老师，对于外泌体，我还是个新手。
作者: wzttray    时间: 2017-9-2 14:22
楼主问一下，你用浓缩之后提取效果怎么样？
作者: lczyld    时间: 2017-9-2 16:09
wzttray 发表于 2017-9-2 14:22
楼主问一下，你用浓缩之后提取效果怎么样？

提了一次，跑蛋白发现没有CD63的条带   现在在找问题 不知道浓缩的步骤对不对 你呢
作者: wzttray    时间: 2017-9-11 09:34
lczyld 发表于 2017-9-2 16:09
提了一次，跑蛋白发现没有CD63的条带   现在在找问题 不知道浓缩的步骤对不对 你呢  ...

我是用超离的方法，检测到CD63，但是没有TSG101
作者: qyjinghui    时间: 2017-9-14 09:04
tshenbin 发表于 2017-8-2 21:57
建议你用Amicon Ultra-15 100K NMWL进行超滤浓缩，这样可以减少上清体积。

请教老师超滤的转速，最后需要用多少pbs冲洗滤膜，收集外泌体成分呢？
作者: tshenbin    时间: 2017-9-23 04:01
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽
作者: 丫丫    时间: 2017-10-26 11:17
baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或g ...

您好，请问您有关于无血清培养的相关文献吗？有的话能不能分享一下？感激不尽！！！
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-10-27 03:43
丫丫 发表于 2017-10-26 11:17
您好，请问您有关于无血清培养的相关文献吗？有的话能不能分享一下？感激不尽！！！ ...

这个手头还真没有，因为我自己的实验都是用的exo-free FBS养原代胶质细胞。
你试着参考Lonza网站：http://www.lonza.com/products-se ... d-formulations.aspx，有无血清培养的产品。
作者: 丫丫    时间: 2017-10-27 08:08
baishixiaoyaozi 发表于 2017-10-27 03:43
这个手头还真没有，因为我自己的实验都是用的exo-free FBS养原代胶质细胞。
你试着参考Lonza网站：http:/ ...

好的，再次感谢！
作者: 丫丫    时间: 2017-10-27 08:15
baishixiaoyaozi 发表于 2017-10-27 03:43
这个手头还真没有，因为我自己的实验都是用的exo-free FBS养原代胶质细胞。
你试着参考Lonza网站：http:/ ...

老师，您好！能透露一下您用的exo-free FBS是什么牌子的吗？
作者: 丫丫    时间: 2017-10-27 08:15
baishixiaoyaozi 发表于 2017-10-27 03:43
这个手头还真没有，因为我自己的实验都是用的exo-free FBS养原代胶质细胞。
你试着参考Lonza网站：http:/ ...

老师，您好！能透露一下您用的exo-free FBS是什么牌子的吗？
作者: 丫丫    时间: 2017-10-27 08:16
baishixiaoyaozi 发表于 2017-10-27 03:43
这个手头还真没有，因为我自己的实验都是用的exo-free FBS养原代胶质细胞。
你试着参考Lonza网站：http:/ ...

您好！能透露一下您用的exo-free FBS是什么牌子的吗？
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-10-27 20:08
丫丫 发表于 2017-10-27 08:16
您好！能透露一下您用的exo-free FBS是什么牌子的吗？

自己超离制备的。
https://www.thermofisher.com/us/ ... e-depleted-fbs.html

https://www.systembio.com/produc ... -isolation/exo-fbs/
这两个链接是文章里经常看见的牌子.
作者: qyjinghui    时间: 2017-10-29 17:12
baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或g ...

还有个问题想请教老师，我们想研究加药处理后细胞外泌体内容物的改变，看到过两种方式，1.加药处理2天后，连同药物和培养液一起丢弃，添加新的培养基继续培养收集外泌体。2.加药处理2天后，将含有药物的培养液收集并分离外泌体成分。这两种哪个方法更科学呢。感谢回答，谢谢
作者: 丫丫    时间: 2017-10-31 09:51
baishixiaoyaozi 发表于 2017-10-27 20:08
自己超离制备的。
https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell- ...

好的，非常感谢！
作者: 夏天    时间: 2017-10-31 20:20
lczyld 发表于 2017-8-2 07:59
谢谢前辈的热心回答！请问您的120ml上清直接拿去超离么，看到文献里有浓缩这一步，不知道怎么做到的。因 ...

请问你买的这个试剂盒效果好吗
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-10-31 23:57
qyjinghui 发表于 2017-10-29 17:12
还有个问题想请教老师，我们想研究加药处理后细胞外泌体内容物的改变，看到过两种方式，1.加药处理2天后 ...

我倾向于选择第一个实验方案。
作者: 楠楠    时间: 2017-12-7 10:33
baishixiaoyaozi 发表于 2017-8-1 23:36
这个很难给你确切答案，不同的细胞系分泌exosome的能力不一样，对血清饥饿的耐受不一样。你可以上pubmed或g ...

老师，您好，我想问你一下在采用pbs重悬洗去蛋白质的的时候是每个管加10ml吗？还是将几个离心管合到一起啊，
作者: baishixiaoyaozi    时间: 2017-12-7 21:18
楠楠 发表于 2017-12-7 10:33
老师，您好，我想问你一下在采用pbs重悬洗去蛋白质的的时候是每个管加10ml吗？还是将几个离心管合到一起 ...

每个管加PBS，洗完后重悬再合并到一起。
作者: 外泌体小天使    时间: 2018-4-16 14:46
lczyld 发表于 2017-9-2 16:09
提了一次，跑蛋白发现没有CD63的条带   现在在找问题 不知道浓缩的步骤对不对 你呢  ...

CD63跑完之后 它的分子量应该就不是24KD了 应该是43KD，你是用的abcam的抗体吗？




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