外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 外泌体wb结果 [打印本页]
作者: CARD    时间: 2017-8-13 20:23
标题: 外泌体wb结果
最近用60mL细胞上清液提取外泌体跑了一次wb，但是结果很奇怪，细胞刮取蛋白裂解后三个指标都出现了，而外泌体却一个都没有，这是什么原因？是我没提取成功，还是浓度太低，又或是其他什么原因，只能求助于大家

作者: kao3234659    时间: 2017-8-14 05:10
贴一下你的外泌体分离的流程。
作者: CARD    时间: 2017-8-14 09:09
kao3234659 发表于 2017-8-14 05:10
贴一下你的外泌体分离的流程。

400g 10min, 2000g 30min,10000g 30min,100000g 70min,取沉淀PBS洗涤，100000g 70min,取沉淀PBS重悬
作者: 只是睡着了    时间: 2017-8-14 09:18
想问下你样本超离之后有沉淀看到么？
作者: CARD    时间: 2017-8-14 10:24
只是睡着了 发表于 2017-8-14 09:18
想问下你样本超离之后有沉淀看到么？

有看到一点点的沉淀
作者: meiling    时间: 2017-8-15 08:40
请问你做WB的流程是什么呢？有加DTT吗
作者: CARD    时间: 2017-8-16 09:50
meiling 发表于 2017-8-15 08:40
请问你做WB的流程是什么呢？有加DTT吗

没加,直接加loading了
作者: slxiang    时间: 2017-8-23 17:23
CARD 发表于 2017-8-16 09:50
没加,直接加loading了

我想请教的是：你超离用的是什么型号的离心机，rotor，和离心管？60ml一起离的么？
作者: slxiang    时间: 2017-8-23 17:24
CARD 发表于 2017-8-16 09:50
没加,直接加loading了

我是新手，刚开始摸索提exosome的方法~望多指教
作者: CARD    时间: 2017-8-23 19:52
slxiang 发表于 2017-8-23 17:24
我是新手，刚开始摸索提exosome的方法~望多指教

贝克曼的，sw41ti
作者: zhaorui1993    时间: 2017-9-25 19:29
麻烦问一下，CD63分子量是多少
作者: CARD    时间: 2017-9-26 20:23
zhaorui1993 发表于 2017-9-25 19:29
麻烦问一下，CD63分子量是多少

CD63的分子量好像不确定，50到30之间都有,抗体说明书上写的
作者: 笨笨珍    时间: 2017-11-30 00:04
能把你做WB的具体步骤发出来嘛？大家可以一起讨论下，我跟出现一样的情况。
作者: rcg0516    时间: 2018-7-8 17:09
楼主上样的时候加RIPA裂解了吗？
作者: peggy4598690    时间: 2018-7-20 01:01
slxiang 发表于 2017-8-23 17:23
我想请教的是：你超离用的是什么型号的离心机，rotor，和离心管？60ml一起离的么？ ...

看到顺便分享一下，我是使用贝克曼的L100K离心机，Rotor是Type70.1 Ti ，一次离心80mL后，使用100微升的PBS重悬
作者: xiaobairenou    时间: 2018-9-10 15:37
请问你的这幅带marker的条带图怎么曝光出来的？ 我们成像时marker不显示
作者: 阿赵    时间: 2018-9-17 20:22
meiling 发表于 2017-8-15 08:40
请问你做WB的流程是什么呢？有加DTT吗

请问一下，前段时间不是还说不要用有DTT的buffer吗。  那要加的话不就和常见那种没什么区别啦。 到底用哪种呀， 跑不出来啊。 我既用过没加的也用过加了的，均没有跑出来。
作者: 一粟    时间: 2018-9-28 17:26
我也是。提取的细胞总蛋白可以跑出CD63 CD9，但是外泌体不行，另外你们提取外泌体全程都是在冰上操作吗？我怎么超离完后根本看不到沉淀呢
作者: 济慈    时间: 2018-12-12 15:11
一粟 发表于 2018-9-28 17:26
我也是。提取的细胞总蛋白可以跑出CD63 CD9，但是外泌体不行，另外你们提取外泌体全程都是在冰上操作吗？我 ...

我们是用超离提取的，也是偶尔能看到沉淀，在管底，圆圆的很小一块，没有在冰上操作
作者: 济慈    时间: 2018-12-12 15:12
一粟 发表于 2018-9-28 17:26
我也是。提取的细胞总蛋白可以跑出CD63 CD9，但是外泌体不行，另外你们提取外泌体全程都是在冰上操作吗？我 ...

我们是用超离提取的，也是偶尔能看到沉淀，在管底，圆圆的很小一块，没有在冰上操作
作者: ydzheng    时间: 2019-3-5 20:55
济慈 发表于 2018-12-12 15:12
我们是用超离提取的，也是偶尔能看到沉淀，在管底，圆圆的很小一块，没有在冰上操作 ...

请问你找到问题原因了吗？我是新手也是出现这种状况，不知道是哪出了问题

作者: 邱邱--    时间: 2019-3-25 19:10
请问一下提取的外泌体WB之间加细胞裂解液吗
作者: DBLB    时间: 2019-10-21 12:11
阿赵 发表于 2018-9-17 20:22
请问一下，前段时间不是还说不要用有DTT的buffer吗。  那要加的话不就和常见那种没什么区别啦。 到底用哪 ...

非还原性的loading buffer
作者: DBLB    时间: 2019-10-21 12:12
一粟 发表于 2018-9-28 17:26
我也是。提取的细胞总蛋白可以跑出CD63 CD9，但是外泌体不行，另外你们提取外泌体全程都是在冰上操作吗？我 ...

是在冰上做的。我也看不见。你做出来浓度怎么样
作者: cxx123    时间: 2023-6-27 10:25
请问找到解决方法了吗？可能你的浓度太低了，你用多少PBS重悬？我没有用裂解液重悬的，是细胞跟外泌体都有条带



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