【Theranostics】NK细胞外泌体具有杀伤黑色素瘤的作用 - 外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

目的：外泌体是从正常细胞和肿瘤细胞释放的纳米囊泡，在细胞培养上清液和人类生物液体中可检测到。虽然以前的研究已经探索了从癌细胞释放的外泌体，但很少了解正常细胞释放的外泌体的功能。自然杀伤（NK）细胞表现出对转移性或血液恶性肿瘤的快速免疫，并且已经在临床上开发NK细胞的抗肿瘤特性。然而，源自NK细胞的外泌体的特征和功能仍然是未知的。在本研究中，研究人员在体外和体内探讨了NK细胞衍生的外泌体介导的抗侵袭性黑色素瘤的抗肿瘤作用。

方法：用增强的萤火虫萤光素酶（effluc）和thy1.1基因转染B16F10细胞，用微珠免疫筛选thy1.1阳性细胞。使用RT-PCR，蛋白质印迹和荧光素酶活性测定来鉴定所得到的B16F10/effluc细胞。通过超速离心和密度梯度超速离心分离来自NK-92MI细胞的外泌体（NK-92 Exo）。研究人员还进行了酶联免疫吸附测定法来测量保留在NK-92 Exo细胞中的细胞因子。NK-92外泌体通过透射电子显微镜和蛋白质印迹进行表征。使用生物发光成像系统（BLI）和CCK-8测定法测定NK-92Exo对癌细胞的体外细胞毒性。为了研究NK-92 Exo对健康细胞的可能副作用，研究人员还使用人肾Phoenix™-Alymp细胞系进行BLI和CCK-8测定。流式细胞术和Western印迹证实，NK-92外泌体诱导B16F10/effluc细胞凋亡。在体内，使用B16F10/effluc细胞异种移植模型来检测NK-92外泌体的免疫治疗效果。将NK-92 Exo注射到肿瘤中，并使用IVIS Lumina成像系统和超声成像监测肿瘤生长进程。在体内实验后监测肿瘤质量。

结果：RT-PCR和Western blotting检测了B16F10/effluc细胞中的effluc基因表达和蛋白水平。使用BLI测定发现B16F10/effluc活性随着细胞数量的增加而增加。对于NK-92 Exo表征，western blotting检测了超速离心和密度梯度分离的外泌体。结果证实，NK细胞衍生的外泌体表达两种典型的外泌体蛋白，即CD63和ALIX。通过蛋白质印迹分析证明NK-92 Exo提供了两种功能性NK蛋白，即穿孔素和FasL。此外还证实了FasL是在膜上表达的。酶联免疫吸附测定结果表明，NK-92 Exo可以分泌影响细胞增殖信号通路的肿瘤坏死因子（TNF）-α。通过BLI（p<0.001）和CCK-8测定（p<0.001）证实NK-92Exo对体外B16F10/effluc细胞的抗肿瘤作用。此外，在正常健康细胞中，即使在共培养24小时后，NK-92Exo也没有显示出显著的副作用。在体内实验中，与对照组相比，载体对照组肿瘤显著增加（p<0.05）。

Liya Zhu, Senthilkumar Kalimuthu, Prakash Gangadaran, Ji Min Oh, Ho Won Lee, Se Hwan Baek, Shin Young Jeong, Sang-Woo Lee, Jaetae Lee, and Byeong-Cheol Ahn. Exosomes Derived From Natural Killer Cells Exert Therapeutic Effect in Melanoma.Theranostics. 2017; 7(10): 2732–2745. Published online 2017 Jul 7. doi: 10.7150/thno.18752

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