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标题: 外泌体浓度非常非常低 [打印本页]

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作者: husthuagai    时间: 2018-1-5 16:31
标题: 外泌体浓度非常非常低


我提取了几次外泌体，使用超速离心的方法。每次测的浓度都是特别低。具体如下：肿瘤细胞200ml培养48h的上清（去除外泌体的10%培养基），2000g 10min去除死细胞，使用超滤管浓缩到25ml，18，000g 20min去除细胞碎片，然后两次12万g 70min，最后离心后，我还是能看到明显的沉淀的，然后我用1ml PBS重悬，最后用0.22um滤器过滤。
这是我的简要步骤。
我在使用0.22滤器前和滤器后测浓度，bca法，分别是0.08ug/ul、0.05ug/ul。这也太低了！！！但是我明明看到沉淀了。这个我已经重复三次了。每次都差不多！
我真的好头痛，这到底是为什么？
求求哪位大神救救我，我真的找不到原因了！
先谢谢！！！

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作者: 芮苏遥    时间: 2018-1-5 16:51
1.沉淀量？拍个照更好参考
2.细胞量多少？或者说培养瓶或皿的细胞密度？
3.细胞类型会影响外泌体产量

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作者: 蓝泪陨星    时间: 2018-1-5 16:57
是不是BCA测不出来？我用试剂盒提取的外泌体，用BCA测不出来。正在考虑用其它检测方法

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作者: husthuagai    时间: 2018-1-5 17:03

芮苏遥 发表于 2018-1-5 16:51
1.沉淀量？拍个照更好参考
2.细胞量多少？或者说培养瓶或皿的细胞密度？
3.细胞类型会影响外泌体产量 ...

1.下次做的时候拍照上传给您看下
2，用的15cm的培养皿，都是长到70%左右换成去外泌体的培养基，然后48h，一般收上清时候>90%的密度
3. 膀胱肿瘤细胞系，我也是尝试了另一个细胞系，含量更加低。同时做电镜，现在的细胞系还能找到几个外泌体在一起的图片，另一个细胞系只能找到单个的外泌体图片，而且很少

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作者: husthuagai    时间: 2018-1-5 17:09

蓝泪陨星 发表于 2018-1-5 16:57
是不是BCA测不出来？我用试剂盒提取的外泌体，用BCA测不出来。正在考虑用其它检测方法 ...

测不出来不可能吧，浓度很低，不要把你的外泌体稀释20倍，稀释10倍或者不稀释试试

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作者: 蓝泪陨星    时间: 2018-1-5 20:35

husthuagai 发表于 2018-1-5 17:09
测不出来不可能吧，浓度很低，不要把你的外泌体稀释20倍，稀释10倍或者不稀释试试 ...

我说的“测不出来”指的是浓度很低（表达有误），和你差不多

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作者: 阿君    时间: 2018-1-6 15:38
裂解了吗 测之前？

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作者: 三莫    时间: 2018-1-6 19:32
同认为1ml太多了，试试100ul

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作者: 芮苏遥    时间: 2018-1-7 00:30

husthuagai 发表于 2018-1-5 17:03
1.下次做的时候拍照上传给您看下
2，用的15cm的培养皿，都是长到70%左右换成去外泌体的培养基，然后48h， ...

细胞状态可以的话，尝试增加开始收集上清细胞密度（90%左右）和收集时间（我有试过最长96h的）。
15cm dish 我加12ml上清，试过life 试剂盒和超离，200ml上清超离所得沉淀我大概用了200ul重悬
还有微膜过滤步骤是必须的吗，会不会过滤损失掉？还有不清楚过滤会不会影响外泌体结构稳定

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作者: SYSUCC-Deng    时间: 2018-1-7 23:56

芮苏遥 发表于 2018-1-7 00:30
细胞状态可以的话，尝试增加开始收集上清细胞密度（90%左右）和收集时间（我有试过最长96h的）。
15cm di ...

15cmdish才加12ml培养基吗？太少了吧。

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作者: 小朋友玩    时间: 2018-1-9 08:41
我是在对数生长期开始用无血清的培养基饥饿处理,70毫升上清用100ul重悬,BCA法测的,适当增加了BCA法中的孵育时间

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作者: cangsongaoxue    时间: 2018-1-9 15:00
我看文献都是100微升的PBS重悬的。

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作者: cangsongaoxue    时间: 2018-1-9 15:01
我看文献都是100微升的PBS重悬的。

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作者: 芮苏遥    时间: 2018-1-10 08:46

SYSUCC-Deng 发表于 2018-1-7 23:56
15cmdish才加12ml培养基吗？太少了吧。

还试过9ml，12ml 48h是可以的~延长时间的话，局部就容易干掉了

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作者: 外泌体小天使    时间: 2018-4-16 13:56

芮苏遥 发表于 2018-1-10 08:46
还试过9ml，12ml 48h是可以的~延长时间的话，局部就容易干掉了

楼主，你现在提的怎么样了，浓度上来了吗？

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作者: 外泌体小天使    时间: 2018-4-16 13:57

芮苏遥 发表于 2018-1-10 08:46
还试过9ml，12ml 48h是可以的~延长时间的话，局部就容易干掉了

楼主，请问你的问题解决了吗，外泌体浓度上来了吗？怎么解决的，说下，谢了。

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作者: 芮苏遥    时间: 2018-5-18 11:54

外泌体小天使 发表于 2018-4-16 13:57
楼主，请问你的问题解决了吗，外泌体浓度上来了吗？怎么解决的，说下，谢了。 ...

sorry，太久没上来看消息。外泌体浓度跟细胞自身产量有关，我这个基因刚好抑制RAB家族，释放量就会减少，跟对照相比同样处理，离心后就是小小颗沉淀。如果超速离心的话还好，可以合并重悬，试剂盒的话就比较费钱了

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作者: 425612liyuan    时间: 2019-7-18 13:22
后来用了什么方法提高产量的

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作者: 芮苏遥    时间: 2019-8-12 08:56

425612liyuan 发表于 2019-7-18 13:22
后来用了什么方法提高产量的

后来就没有后来啦，因为毕业了。不过现在要重新开始相关课题了。我jio得可以试试挤压制备和牛奶外泌体包装

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作者: WinterBlinder    时间: 2021-5-16 20:50
感谢分享

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