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标题: 【视频】外泌体电镜protocol [打印本页]
作者: Johnny 时间: 2018-2-3 11:13
标题: 【视频】外泌体电镜protocol
本帖最后由 Johnny 于 2018-2-3 11:15 编辑
近日，韩国研究人员在Journal of Visualized Experiments杂志上发布了一份外泌体电镜的protocol。小编将视频分享给小伙伴们(视频链接见文末）。
该方法不仅介绍了我们传统的负染方法，也介绍了包埋切片法，看其文章中show的拍摄效果还不错，故而分享给大家参考。
外泌体负染效果图
外泌体包埋切片TEM拍摄效果图
protocol就不给大家翻译啦，直接贴给大家：
1. Block Preparation, Sectioning, Staining and Imaging of the Exosome
1. Pellet the exosomes from culture supernatant of HCT116 cells by centrifugation at 100,000 x g for 1.5 h23. Remove the culture supernatant
and carefully fix the purified exosome pellet with 1 mL of 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate solution (pH 7.0) for 1 h at 4 °C.
For 0.1 M sodium cacodylate, dissolve 4.28 g cacodylic acid in 160 mL of distilled water (DW). Adjust pH to 7.4 with 0.1 M HCl then make up
to 200 mL with distilled water.
2. Remove the fixative and rinse the pellets with 1 mL of 0.1 M sodium cacodylate buffer at room temperature. Repeat three times with each change lasting 10 min.
3. Post-fix the samples with 1 mL of 2% Osmium tetroxide for 1 h at 4 °C.
4. Remove the fixative and rinse three times with 0.1 M sodium cacodylate buffer every 10 min.
5. Incubate for 10 min with a graded acetone series (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respectively) on the shaker.
6. Remove the acetone and incubate the solution of 3:1 acetone:low viscosity embedding mixture for 30 min. The exosome pellet is in the tube.
7. Remove the medium and add 1:1 acetone:low viscosity embedding mixture medium, then incubate for 30 min.
8. Remove the medium and add 1:3 acetone:low viscosity embedding mixture medium, then incubate for 30 min.
9. Remove the medium and add 100% low viscosity embedding mixture and incubate overnight at room temperature.
10. Embed the sample in pure low viscosity embedding mixture using the embedding mold and bake for 24 h at 65 °C.
11. Prepare sections with 60 nm thickness through an ultra-microtome.
12. Double-stain with 2% uranyl acetate for 20 min and lead citrate for 10 min.
For Reynolds lead solution, add 1.33 g of lead nitrate and 1.76 g of sodium citrate to a total of 50 mL distilled water.
13. Observe the grid under transmission electron microscopy at 80 kV.
14. Click "Acquire" and then click "File" and "Save as" in CCD camera system under the electron microscope at 80 kV. Follow automatic settings
for the exposure time.
2. Immuno-staining of Sections and Imaging
1. Cut 60 nm ultrathin sections using an ultra-microtome, and collect on the nickel grid.
2. Incubate grids in 50 µL drops of 0.02 M glycine for 10 min to quench free aldehyde groups.
3. Rinse in 100 μL of DW three times each for 10 min. Incubate at room temperature for 1 h in PBS containing 1% BSA.
4. Incubate grids in 50 - 100 µL drops of anti KRS antibody24 (1:100 in PBS containing 0.1% BSA) for 1 h (If necessary, this step should be carried out at 4 °C overnight.)
5. Wash grids with five separate drops (50 µL) of PBS containing 0.1% BSA for 10 min each.
6. Transfer grids to drops of 2nd antibody for 1 h (anti-rabbit IgG conjugated to 10 nm gold particle (1:100) in PBS containing 0.1% BSA).
7. Wash grids with five separate drops (50 µL) of PBS containing 0.1% BSA each 10 min.
8. Double-stain with 2% uranyl acetate for 20 min under dark conditions and with Reynold's lead citrate for 10 min, respectively.
9. Click "Acquire" and then click "File" and "Save as" in CCD camera system under a TEM at 80 kV. Exposure time followed automatic settings.
3. Negative Staining
1. Glow-discharge the thin formvar/carbon film coated 200 mesh copper EM grids for 1 min by glow discharger.
2. Fix purified exosomes with 1 mL of 2% Paraformaldehyde (PFA) for 5 min.
Caution: Paraformaldehyde fumes are toxic. All work should be done in a ventilated fume hood.
3. Load 5 - 7 µL exosome suspension solution on the grid and incubate for 1 min. If the concentration of exosome is too high, dilute the concentration to 1/2 - 1/5.
4. Immediately stain with the ~20 drops of filtered 1% uranyl acetate (UA) solution on the surface of the EM grid by syringe.
5. Remove the excess UA solution on the grid by contacting the grid edge with filter paper.
6. Quickly rinse the grid with a drop of water. This step will remove the excess staining solution.
7. Place the grid on the table by holding with tweezers, and cover the grid partially with a culture dish to dry for 10 min under room temperature.
8. Store the grid in an EM grid box for future observation by a TEM at 80 kV.
4. Whole Mount for Immunostaining
1. Glow-discharge the thin formvar/carbon film coated 200 mesh copper EM grids for 30 s.
2. Fix purified exosomes with 1 mL of 2% Paraformaldehyde (PFA) for 5 min.
Caution: Paraformaldehyde fumes are toxic. All work should be done in a ventilated fume hood.
3. Load 5 - 7 µL fixed exosome solution on the grid and incubate for 5 min. Rinse with 100 µL of PBS three times each for 10 min.
4. Treat grids with 50 µL of 0.05 M glycine for 10 min to quench free aldehyde groups.
5. Transfer grids to a drop of blocking buffer (PBS containing 1% BSA) for 30 min.
6. Incubate grids with 50 - 100 µL anti PD-L1 antibody (1:100 in PBS containing 0.1% BSA) for 1 h (if necessary, this step should be carried out at 4 °C overnight).
7. Wash grid with five separate drops (50 µL) of PBS containing 0.1% BSA for 10 min each.
8. Transfer grid to a drop of 2nd antibody for 1 h. Anti-mouse IgG conjugated to 9 - 11 nm gold particle diluted at 1:100 in PBS containing 0.1% BSA.
9. Wash grid with five separate drops (50 µL) of PBS containing 0.1% BSA for 10 min each. Wash grid with two separate drops (50 µL) of DW.
Perform negative staining with 2% uranyl acetate as described from 3.4 to 3.8.
10. Store the grid in an EM grid box for future observation by a TEM at 80 kV.
参考文献：
Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56482, doi:10.3791/56482 (2018).
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作者: pengqiao0605 时间: 2018-2-3 23:03
非常好的总结，好好拜读
作者: zlpxiangya 时间: 2018-2-4 16:19
赞！感谢楼主分享!
作者: 我是外泌体 时间: 2018-2-5 13:50
感谢分享
作者: haks 时间: 2018-2-5 15:13
学习学习，谢谢！
作者: kyg 时间: 2018-2-5 15:49
看起来不错，过来学习学习
作者: 胖子的心境 时间: 2018-2-5 16:05
感谢分享
作者: 简而化之 时间: 2018-2-5 16:41
感谢，他这个怎么那么多vesicles
作者: VTZFLTD 时间: 2018-2-6 12:54
谢谢分享，谢谢
作者: cyclone2009 时间: 2018-2-6 17:46
学习学习！！
作者: lyq119 时间: 2018-2-7 10:22
非常感谢
作者: 蓝泪陨星 时间: 2018-2-11 16:21
楼主辛苦，谢谢分享
作者: songzizhu 时间: 2018-2-22 12:37
学习了，非常感谢。
作者: 云淡风清1210 时间: 2018-2-24 01:25
感谢大神
作者: CARD 时间: 2018-2-24 14:31
感谢分享
作者: 17843121440 时间: 2018-2-27 12:26
感谢分享，好好研究研究
作者: bigtmac 时间: 2018-2-28 11:22
感谢大神分享
作者: 外泌小白 时间: 2018-2-28 14:43
谢谢分享
作者: 糖宝 时间: 2018-3-4 10:51
谢谢群主分享
作者: exosome111 时间: 2018-3-5 17:02
急需学习
作者: 只会翻身的咸鱼 时间: 2018-3-6 09:03
感谢楼主！
作者: koer1988 时间: 2018-3-6 14:56
感谢楼主分享
作者: 大麦茶 时间: 2018-3-6 16:45
非常好，刚好需要。谢谢！
作者: xxxxx 时间: 2018-3-6 20:22
11111111111111111111
作者: acoolachen 时间: 2018-3-10 17:36
谢谢分享！！！
作者: acoolachen 时间: 2018-3-12 16:31
Fix purified exosomes with 1 mL of 2% Paraformaldehyde (PFA) for 5 min.
大神，这都加了1ml了，本来样品就挺少吧，稀释这么多倍，还怎么测？
作者: 萨仁其其格 时间: 2018-3-15 13:51
实用，学习
作者: 步步唧唧 时间: 2018-3-15 16:22
学习学习
作者: 伊森007 时间: 2018-3-16 09:59
感谢分享
作者: treetree 时间: 2018-3-16 11:38
感谢楼主！
作者: lovecm 时间: 2018-4-1 23:33
学习学习！！
作者: wangjiachen 时间: 2018-4-3 17:08
感谢分享
作者: xiaodiao 时间: 2018-4-3 22:32
感谢分享
作者: Dr_wkk 时间: 2018-4-4 10:06
感谢分享
作者: wzykdxxzzsyjs 时间: 2018-4-5 10:49
我们学校的的电镜中心不给做负染。。。。，不知道为什么
作者: 1055127297 时间: 2018-4-11 20:42
非常感谢
作者: hellzhu 时间: 2018-4-12 15:55
感谢分享
作者: 小勒 时间: 2018-4-21 12:49
想看一下，谢谢分享
作者: nienie 时间: 2018-5-3 13:53
感谢大神的分享，好好学习一下
作者: 滴哩嘟噜1217 时间: 2018-5-6 08:51
哈哈，总是能在这里找到出处，谢谢
作者: yuhuan 时间: 2018-5-8 13:17
感谢楼主分享
作者: 阿赵 时间: 2018-5-21 20:57
哇瑟，好多资料。
作者: 布酱 时间: 2018-5-21 21:11
谢谢大神分享！！！
作者: Jayden 时间: 2018-5-21 21:29
谢谢楼主分享
作者: 悠灵 时间: 2018-6-14 09:41
拜读
作者: 张小贝 时间: 2018-6-18 22:36
看不了呜呜
作者: 芝麻配海带 时间: 2018-6-19 11:46
谢谢分享 嘻嘻嘻嘻想
作者: liuwenju2014 时间: 2018-6-22 09:41
太好啦。正在找这方面的文献
作者: ran0904 时间: 2018-7-12 12:16
作者: Nightelf 时间: 2018-7-13 09:00
万分感谢，辛苦啦
作者: gxshen 时间: 2018-7-13 11:57
万分感谢，辛苦啦
作者: xyz 时间: 2018-7-19 15:48
辛苦了，非常感谢
作者: xu9709426 时间: 2018-7-23 10:08
非常好，收藏了！
作者: 魔芋舂 时间: 2018-7-24 01:06
谢谢分享
作者: EVA120120 时间: 2018-7-31 20:51
谢谢分享
作者: 亲爱的小八 时间: 2018-8-23 14:49
学习了，谢谢
作者: xjxahh 时间: 2018-9-6 08:02
学习一下，电镜还没做
作者: haoping_mao 时间: 2018-9-23 14:14
谢谢分享
作者: euark 时间: 2018-9-24 21:37
非常好的内容 谢谢分享
作者: xinxin 时间: 2018-9-25 17:13
哇，厉害厉害，谢谢楼主
作者: petpan0107 时间: 2018-9-28 10:56
作者: guisitong2 时间: 2018-9-29 17:28
很好很强大
作者: xllc95 时间: 2018-10-6 13:44
感谢分享
作者: 黄莹莹 时间: 2018-10-6 19:22
感谢分享
作者: meixilihui 时间: 2018-10-7 16:50
谢谢分享
作者: speedsea 时间: 2018-10-10 21:02
学习一下
作者: qinbonect 时间: 2018-10-20 18:51
谢谢楼主
作者: teddy溶溶 时间: 2018-10-25 15:56
楼主辛苦
作者: easonlin 时间: 2018-10-29 09:12
谢谢分享~
作者: 曲奇 时间: 2018-10-29 14:20
h很不错呢，谢谢！
作者: xieyy 时间: 2018-11-2 10:13
谢谢分享
作者: tanzixun101265 时间: 2018-11-3 11:46
5666666666666666666666666
作者: 我爱学习 时间: 2018-11-4 13:48
ganxiefenxiang!
作者: 凉陌语 时间: 2018-11-20 16:27
赞
作者: zbj4545@126.com 时间: 2018-12-4 21:54
赞赞赞赞赞，感谢分享！
作者: 411762304 时间: 2019-2-13 17:05
谢谢楼主分享
作者: mangchu 时间: 2019-3-6 11:34
谢谢大神
作者: 大大大脐橙 时间: 2019-3-6 16:41
谢谢版主！！！
作者: SurgeonChao 时间: 2019-4-4 23:57
非常好的资料。感谢LZ分享
作者: zzzzz994 时间: 2019-4-8 17:00
很棒的文献分享，谢谢！
作者: 电镜服务 时间: 2019-4-15 18:06
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽
作者: yikezhen 时间: 2019-4-18 19:42
感谢分享
作者: leety 时间: 2019-4-19 10:58
感谢分享，学习中
作者: fancuiqin 时间: 2019-4-19 17:56
HAOHAOHAO
作者: liuting628 时间: 2019-4-26 19:10
感谢分享！
作者: 穹极之光 时间: 2019-4-27 17:44
棒棒哒，一百个赞
作者: zhangxuan 时间: 2019-4-29 11:12
很不错的分享，学习了
作者: morgile 时间: 2019-5-10 16:26
赞赞！！
作者: hualishuer 时间: 2019-6-14 17:26
谢谢分享 准备尝试一下
作者: YQwang 时间: 2019-8-15 10:14
视频直观易懂，谢谢分享
作者: sujiachen 时间: 2019-8-15 11:01
谢谢楼主
作者: CheungKL 时间: 2019-9-25 15:56
谢谢分享
作者: XueqingMa 时间: 2019-9-26 09:23
谢谢分享
作者: 945980345 时间: 2019-9-26 09:38
学习一下
作者: fay 时间: 2019-9-27 17:43
很好的分享，非常感谢感谢
作者: 羽翼灬世羡 时间: 2019-9-29 15:41
学习学习
作者: easy2014 时间: 2019-10-15 10:28
真的是太棒了，整好需要
作者: yczcj 时间: 2019-11-14 10:59
好好学习一下
作者: klhstc 时间: 2019-12-1 12:00
作者: gysan1943 时间: 2019-12-2 08:50
太棒了，谢谢分享
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