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标题: BCA测蛋白浓度问题 [打印本页]
作者: kadak007    时间: 2015-5-28 00:26
标题: BCA测蛋白浓度问题
请教下各位，从约80毫升胰腺癌细胞培养上清（4个大瓶的量）中提取的外泌体（超速离心法），重悬于约100微升1×PBS，做BCA测蛋白浓度时，
取多少体积外泌体重悬液？
用什么样的裂解液？
用多少体积的裂解液？

有没有比较成熟的方案、或者一些指导原则？非常感谢~


作者: niceman1987    时间: 2015-5-28 10:53
BCA测蛋白浓度，不应该PBS重悬吧，应该直接加裂解液后检测啊
作者: kadak007    时间: 2015-5-28 14:23
niceman1987 发表于 2015-5-28 10:53
BCA测蛋白浓度，不应该PBS重悬吧，应该直接加裂解液后检测啊

谢谢，再请教下，一般你做的是多少量的外泌体对应多少体积裂解液？  做BCA时全部加样量多少呢？
作者: niceman1987    时间: 2015-5-28 20:03
我还没有进行BCA检测，做完后我们再交流喽
作者: kadak007    时间: 2015-5-28 23:11
niceman1987 发表于 2015-5-28 20:03
我还没有进行BCA检测，做完后我们再交流喽

好的，祝实验顺利~
作者: 惜名    时间: 2015-5-29 07:58
一直用试剂盒的孩子路过。。。
对超离的得率一点概念都没有，坐等版主来回答
作者: kadak007    时间: 2015-5-29 10:10
惜名 发表于 2015-5-29 07:58
一直用试剂盒的孩子路过。。。
对超离的得率一点概念都没有，坐等版主来回答 ...

我用细胞培养上清提取的，超离结束后可出现肉眼可见的白色贴壁物
作者: 六月の雪    时间: 2015-5-29 12:06
楼主也做胰腺癌？同道中人啊
我用的SBI试剂，用PBS重悬后，取个10-20ul出来加裂解液（因为剩下的还想着孵育其他细胞观察个现象啥的）
BCA测浓度，裂解液不敢加多了，第一次做都是尝试，我用了30ul裂解液（我现在觉得加10ul裂解液都够了= =），测的蛋白浓度挺低的，
这个貌似没有成熟方案吧，都是摸着石头过河，有结果就成~
作者: kadak007    时间: 2015-5-29 17:56
六月の雪 发表于 2015-5-29 12:06
楼主也做胰腺癌？同道中人啊
我用的SBI试剂，用PBS重悬后，取个10-20ul出来加裂解液（因为剩下的还想着 ...

终于碰到同道了，幸会幸会啊    我打算下周BCA下
你是用多少体积培养上清提取啊？然后加pbs多少微升重悬呢？是哪种品牌裂解液？
我之前也用SBI试过，完全按说明操作后，并未出现肉眼可见的白色物，象征性的PBS重悬后，电镜下似有似无的有那么几个泡泡。你是怎么处理？
作者: 六月の雪    时间: 2015-5-31 13:49
kadak007 发表于 2015-5-29 17:56
终于碰到同道了，幸会幸会啊    我打算下周BCA下
你是用多少体积培养上清提取啊？然后加pbs多 ...

40多ML的上清，用超滤管浓缩到5mL，再加SBI试剂过夜才能看到肉眼可见的沉淀，加了200ulPBS重悬，约了下周做电镜，裂解液是长期合作的一家国产公司自配自卖的，不算是什么品牌
作者: kadak007    时间: 2015-6-1 18:42
六月の雪 发表于 2015-5-31 13:49
40多ML的上清，用超滤管浓缩到5mL，再加SBI试剂过夜才能看到肉眼可见的沉淀，加了200ulPBS重悬，约了下周 ...

好的，多谢啊，祝实验顺利，常交流~
作者: hexiaoke    时间: 2015-6-2 13:43
不知道楼主后面是怎么做的呢？我也想知道用什么裂解液和取多少体积的裂解液
作者: kadak007    时间: 2015-6-2 19:08
hexiaoke 发表于 2015-6-2 13:43
不知道楼主后面是怎么做的呢？我也想知道用什么裂解液和取多少体积的裂解液 ...

今天用RIPA裂解液试一下，按1:1加，貌似效果还行
作者: ashey    时间: 2015-6-8 14:29
新人一枚，想问下，RIPA裂解后不需要重悬再离心嘛？离心的话用多大转速呢？
作者: kadak007    时间: 2015-6-8 19:46
ashey 发表于 2015-6-8 14:29
新人一枚，想问下，RIPA裂解后不需要重悬再离心嘛？离心的话用多大转速呢？ ...

我这里裂解后没有再次重悬离心
作者: ashey    时间: 2015-6-9 17:25
kadak007 发表于 2015-6-8 19:46
我这里裂解后没有再次重悬离心

不考虑外泌体膜碎片之类的影响吗？
作者: 梦想照进现实    时间: 2015-7-13 08:18
六月の雪 发表于 2015-5-31 13:49
40多ML的上清，用超滤管浓缩到5mL，再加SBI试剂过夜才能看到肉眼可见的沉淀，加了200ulPBS重悬，约了下周 ...

用超滤管浓缩后，是按5ml的量来算SBI试剂的吗？效果怎样呀！最近准备开始做，拿不准要多少上清。求助！
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-7-31 13:28
ashey 发表于 2015-6-9 17:25
不考虑外泌体膜碎片之类的影响吗？

裂解后看不到碎片的
作者: yy8651    时间: 2015-7-31 21:02
惜名 发表于 2015-5-29 07:58
一直用试剂盒的孩子路过。。。
对超离的得率一点概念都没有，坐等版主来回答 ...

你用的哪个盒子？需要用多少细胞上清能提到多少？
作者: 惜名    时间: 2015-8-3 08:33
yy8651 发表于 2015-7-31 21:02
你用的哪个盒子？需要用多少细胞上清能提到多少？

我用SBI的，4-6ml上清即可看到少许沉淀。
当然，各个细胞分泌exo的能力不同，所以你还是要摸索一下。
作者: yy8651    时间: 2015-8-3 09:50
惜名 发表于 2015-8-3 08:33
我用SBI的，4-6ml上清即可看到少许沉淀。
当然，各个细胞分泌exo的能力不同，所以你还是要摸索一下。 ...

同样SBI的kit，但是你有没有测过Exosomes数量或者RNA浓度啊？量太低的表示很是苦恼啊
作者: 惜名    时间: 2015-8-3 09:56
yy8651 发表于 2015-8-3 09:50
同样SBI的kit，但是你有没有测过Exosomes数量或者RNA浓度啊？量太低的表示很是苦恼啊 ...

测过啊  用nano测过，PBS稀释100倍上样还是可以得到比较好的浓度的。。。
作者: yy8651    时间: 2015-8-3 18:50
惜名 发表于 2015-8-3 09:56
测过啊  用nano测过，PBS稀释100倍上样还是可以得到比较好的浓度的。。。

那您有测过RNA或protein的浓度吗
作者: 惜名    时间: 2015-8-4 09:14
yy8651 发表于 2015-8-3 18:50
那您有测过RNA或protein的浓度吗

RNA没提过  蛋白测过的   浓度很好   10ml上清可以得到20ug左右的蛋白。。这是去除血清的培养基，如果用10%FBS培养细胞，手机上清提exo，10ml上清可以得到100-150ug蛋白。。。
作者: wanghx_85    时间: 2015-8-5 09:15
六月の雪 发表于 2015-5-31 13:49
40多ML的上清，用超滤管浓缩到5mL，再加SBI试剂过夜才能看到肉眼可见的沉淀，加了200ulPBS重悬，约了下周 ...

您好，请问您是如何浓缩的？能够发个详细的步骤？还有收集的40度ml的上清是一次性收集？还是多次积攒？多次积攒的上清如何保存？（4度？-20度？-80度？）
作者: 宋梦阳    时间: 2015-8-7 11:42
想问一下BCA法测定EXO蛋白浓度的具体方法，谢谢？！
作者: meme    时间: 2015-10-20 16:13
wanghx_85 发表于 2015-8-5 09:15
您好，请问您是如何浓缩的？能够发个详细的步骤？还有收集的40度ml的上清是一次性收集？还是多次积攒？多 ...

我也想问这个，可以吗？多次积攒的上清液
作者: kasangzc    时间: 2015-11-27 12:27
惜名 发表于 2015-8-3 09:56
测过啊  用nano测过，PBS稀释100倍上样还是可以得到比较好的浓度的。。。

你所说的nano是什么仪器呀
作者: 惜名    时间: 2015-11-27 13:28
kasangzc 发表于 2015-11-27 12:27
你所说的nano是什么仪器呀

就是马尔文的nanosight，很多文章都会提到这个机器来测粒子的直径分布~
作者: kasangzc    时间: 2015-11-27 13:59
惜名 发表于 2015-11-27 13:28
就是马尔文的nanosight，很多文章都会提到这个机器来测粒子的直径分布~

目前我们还没有这个仪器 有没有什么好点的方法测粒子浓度吗？
作者: 惜名    时间: 2015-11-27 14:57
kasangzc 发表于 2015-11-27 13:59
目前我们还没有这个仪器 有没有什么好点的方法测粒子浓度吗？

貌似目前就是这个用的比较多吧，还有一家公司IZON也有机器在做这方面的检测。
我们这个论坛里有他们的帖子，你可以找找看~
作者: kasangzc    时间: 2015-11-27 18:27
惜名 发表于 2015-11-27 14:57
貌似目前就是这个用的比较多吧，还有一家公司IZON也有机器在做这方面的检测。
我们这个论坛里有他们的帖 ...

qNano 吗？   对了， 你在哪个城市工作呀？
作者: 惜名    时间: 2015-11-28 09:21
kasangzc 发表于 2015-11-27 18:27
qNano 吗？   对了， 你在哪个城市工作呀？

嗯  貌似是qNANO，我们论坛里有人用过貌似还不错。
我现在在上海读博士~
作者: kasangzc    时间: 2015-11-28 19:44
惜名 发表于 2015-11-28 09:21
嗯  貌似是qNANO，我们论坛里有人用过貌似还不错。
我现在在上海读博士~

我在南京 离得不远 嘿嘿
作者: zjm337    时间: 2016-1-9 21:01
惜名 发表于 2015-11-27 13:28
就是马尔文的nanosight，很多文章都会提到这个机器来测粒子的直径分布~

这个是必须的吗？你们是怎么做的？你们那有这个仪器吗？
作者: grapetian    时间: 2016-5-12 02:07
六月の雪 发表于 2015-5-31 13:49
40多ML的上清，用超滤管浓缩到5mL，再加SBI试剂过夜才能看到肉眼可见的沉淀，加了200ulPBS重悬，约了下周 ...

请问下你超滤管用的几kd的？浓缩转速和时间是多少?谢谢！
作者: exo    时间: 2016-5-27 22:12
六月の雪 发表于 2015-5-29 12:06
楼主也做胰腺癌？同道中人啊
我用的SBI试剂，用PBS重悬后，取个10-20ul出来加裂解液（因为剩下的还想着 ...

目前正在测浓度，方法跟楼主完全一样，浓度测出来极低，不知楼主现在做的怎么样，找到原因了了吗？我一度怀疑我没有重悬下来
作者: grapetian    时间: 2016-6-30 16:20
我用pbs和裂解液都做过，都能检测啊
作者: sonja_forever    时间: 2016-9-19 11:07
六月の雪 发表于 2015-5-29 12:06
楼主也做胰腺癌？同道中人啊
我用的SBI试剂，用PBS重悬后，取个10-20ul出来加裂解液（因为剩下的还想着 ...

那请问未裂解的、剩下的Exo悬液你会加蛋白酶抑制剂吗？
作者: zhoux18    时间: 2019-6-17 17:52
exo 发表于 2016-5-27 22:12
目前正在测浓度，方法跟楼主完全一样，浓度测出来极低，不知楼主现在做的怎么样，找到原因了了吗？我一度 ...

你好，我遇到了同样的问题，请问你解决了吗？BCA浓度低的问题
作者: DBLB    时间: 2019-10-11 19:04
niceman1987 发表于 2015-5-28 10:53
BCA测蛋白浓度，不应该PBS重悬吧，应该直接加裂解液后检测啊

请教一下，您测出来的蛋白浓度大概在什么范围
作者: DBLB    时间: 2019-10-20 14:46
zhoux18 发表于 2019-6-17 17:52
你好，我遇到了同样的问题，请问你解决了吗？BCA浓度低的问题

请问您解决了这个问题了么。BCA检测蛋白浓度低的问题。我试过沸水浴，加碧云天的RIPA裂解，等方法，蛋白浓度还是非常低。我觉得测得的这个数值并不是真实的情况。因为我看文献中别人测得的浓度比我的要低一个数量级，依然有很好蛋白浓度。
作者: haoyaying1995    时间: 2019-11-14 10:19
wanghx_85 发表于 2015-8-5 09:15
您好，请问您是如何浓缩的？能够发个详细的步骤？还有收集的40度ml的上清是一次性收集？还是多次积攒？多 ...

你好，问题解决了么？我也遇到同样的问题
作者: zhangchao    时间: 2020-7-4 18:03
六月の雪 发表于 2015-5-29 12:06
楼主也做胰腺癌？同道中人啊
我用的SBI试剂，用PBS重悬后，取个10-20ul出来加裂解液（因为剩下的还想着 ...

请问裂解液咋配的呀
作者: zhangchao    时间: 2020-7-4 18:56
haoyaying1995 发表于 2019-11-14 10:19
你好，问题解决了么？我也遇到同样的问题

方便加个微信么  13844196076  我也做外泌体
作者: haoyaying1995    时间: 2020-7-6 09:19
zhangchao 发表于 2020-7-4 18:03
请问裂解液咋配的呀

我用的裂解外泌体的试剂盒



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