外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 说超滤离心管能够浓缩细胞培养液 [打印本页]
作者: bobo    时间: 2015-5-28 00:41
标题: 说超滤离心管能够浓缩细胞培养液
那么，我看到有的师姐用超速离心管离心DNA，那么exosome算是什么呢，选择的分子量是根据什么选择的呢，离心后，超滤离心管中的exosome用什么重悬呢?
作者: 六月の雪    时间: 2015-5-29 11:54
最早那位哥们提出来用3KD的超滤管，我用的10KD的，这个是截留蛋白的分子量，exosome不算蛋白，反正搞不清具体原理，尝试了再说
我用了40ml培养基，3000转离心了大概25-30分钟，浓缩到5-7ml的样子，然后加SBI试剂过夜，可以看到少量沉淀，下周做电镜鉴定
作者: bobo    时间: 2015-5-30 19:48
六月の雪 发表于 2015-5-29 11:54
最早那位哥们提出来用3KD的超滤管，我用的10KD的，这个是截留蛋白的分子量，exosome不算蛋白，反正搞不清具 ...

等你的好消息啊，我也准备做呢.那你用的什么牌子的超滤离心管啊
作者: seallin    时间: 2015-5-30 20:00
浓不浓缩再用kit其实差别差不多，难道浓缩了之后可以少用点kit的溶液，如果这样想，那你的结果一定不好
作者: bobo    时间: 2015-5-30 20:27
seallin 发表于 2015-5-30 20:00
浓不浓缩再用kit其实差别差不多，难道浓缩了之后可以少用点kit的溶液，如果这样想，那你的结果一定不好 ...

跟kit没关系啦，浓缩培养液的目的是想让其中的exosome浓一些
作者: 六月の雪    时间: 2015-5-31 13:55
seallin 发表于 2015-5-30 20:00
浓不浓缩再用kit其实差别差不多，难道浓缩了之后可以少用点kit的溶液，如果这样想，那你的结果一定不好 ...

浓缩我个人觉得就是把培养基里的水去掉一部分，exosome浓度提高了不少，再加Kit我才能看到肉眼可见的沉淀，不浓缩直接加Kit也试过，根本没结果，那实验就更做不下去了....
作者: 六月の雪    时间: 2015-5-31 14:01
bobo 发表于 2015-5-30 19:48
等你的好消息啊，我也准备做呢.那你用的什么牌子的超滤离心管啊

millipore超滤管
作者: evomicscience    时间: 2015-6-1 05:54
The naked pellet means that there is a lot of contamination. Did you do BCA protein assay and NTA? The ratio will tell you a lot.
John
作者: bobo    时间: 2015-6-1 06:30
evomicscience 发表于 2015-6-1 05:54
The naked pellet means that there is a lot of contamination. Did you do BCA protein assay and NTA? T ...

什么意思？
作者: evomicscience    时间: 2015-6-1 07:03
exosome amount from 40 ml of cell culture supernatants should be seen by naked eyes. The while pellet is because of leftover PEG bound to proteins/lipid, of course exosome microvesicle too. Ultracentrifugation of 40 ml of cell culture supernatants will give you less pellet but transparent. If you do NTA (counting particle/exosome absolute number) and protein assay, the ratio NTA/protein of the different isolation method will tell you which one is purer and which method is reliable.
Best,
John
作者: bobo    时间: 2015-6-1 08:33
evomicscience 发表于 2015-6-1 07:03
exosome amount from 40 ml of cell culture supernatants should be seen by naked eyes. The while pelle ...

What is  PEG  meaning?
作者: bobo    时间: 2015-6-1 09:11
六月の雪 发表于 2015-5-31 14:01
millipore超滤管

那您选择40ml的培养液去离心，那么这个离心管您选择的是多少毫升的呢。最后浓缩的液体是留在这个管里面的小管中么？截留蛋白是什么意思呢？
作者: evomicscience    时间: 2015-6-1 09:15
Polyethylene glycol (PEG) is a polymer with the repeated element in parentheses): H-(O-CH2-CH2)n-OH
作者: evomicscience    时间: 2015-6-1 09:18
bobo 发表于 2015-6-1 08:33
What is  PEG  meaning?

Polyethylene glycol (PEG) is a polymer with the repeated element in parentheses:

H-(O-CH2-CH2)n-OH.
作者: bobo    时间: 2015-6-1 09:29
evomicscience 发表于 2015-6-1 07:03
exosome amount from 40 ml of cell culture supernatants should be seen by naked eyes. The while pelle ...

试剂盒要求用4ml的培养液提取exosome,我怎么做才能确定我提的是exosome呢？如果直接从培养瓶中吸取4ml培养液，那么不敢保证这4ml培养液中有足够的exosome.
作者: evomicscience    时间: 2015-6-1 11:55
The different cells will produce the different amount of exosome. The average amount of exosome in cell culture supernatant is around 10^6p/ml. I do not know which kit you use now. If you use PEG-based precipitation kit, you got some, but lose almost half of them. It is good idea to start a large of volume at this point. Labeling exosome and then spike-in will help you figure out the efficiency of isolation.  Checking protein/miRNA and counting particle will help.
Since I do exosome business, I can not suggest that you buy our products.
John
作者: 曼珠沙华002    时间: 2016-2-24 10:54
请问大家都是使用哪个公司的浓缩管? 有具体的超离步骤吗？
作者: mebboy    时间: 2016-4-29 20:58
六月の雪 发表于 2015-5-29 11:54
最早那位哥们提出来用3KD的超滤管，我用的10KD的，这个是截留蛋白的分子量，exosome不算蛋白，反正搞不清具 ...

不是用100KD的吗？
作者: lenoch    时间: 2016-5-3 20:33
seallin 发表于 2015-5-30 20:00
浓不浓缩再用kit其实差别差不多，难道浓缩了之后可以少用点kit的溶液，如果这样想，那你的结果一定不好 ...

Kit 是按照体积的1/2或者1/10加入的，你的体积10ml浓缩到1ml，肯定可以节省很多Kit。而且效果不受影响。
作者: seallin    时间: 2016-5-5 14:10
lenoch 发表于 2016-5-3 20:33
Kit 是按照体积的1/2或者1/10加入的，你的体积10ml浓缩到1ml，肯定可以节省很多Kit。而且效果不受影响。 ...

你说的对，一年前我还不是很懂，哈哈
作者: dancing    时间: 2016-9-20 11:25
六月の雪 发表于 2015-5-29 11:54
最早那位哥们提出来用3KD的超滤管，我用的10KD的，这个是截留蛋白的分子量，exosome不算蛋白，反正搞不清具 ...

请问你是按照浓缩之后的体积加的SBI的试剂吗，比如40ml浓缩到了5ml，就加1ml的试剂，对吗



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