Nature子刊：产量大、靶向好，这种改造的外泌体生产细胞... - 外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

外泌体是细胞衍生的纳米囊泡（50-150 nm），介导细胞间通讯，并且是候选的治疗剂。然而，外泌体信息传递（例如mRNA）效率低、以及缺乏设计外泌体的方法阻碍了它们治疗干预的发展。来自瑞士的研究人员报告了一套EXOsomal转移到细胞（EXOtic）的设备，可以在设计的哺乳动物细胞中高效定制生产设计好的外泌体。这些在外泌体生产细胞中的遗传编码装置增强了外泌体的产生、特异性的mRNA包装以及将mRNA递送到靶细胞的胞质溶胶中，从而实现有效的细胞间通讯而无需浓缩外泌体。植入活小鼠中的工程化生产细胞可持续地将mRNA递送至大脑。在体外和体内模型中，设计的外泌体通过治疗性过氧化氢酶mRNA的递送减轻帕金森病的神经毒性和神经炎症。这些研究结果表明EXOtic装置具有用于RNA递送治疗应用的潜在用途。

为了通过增加外泌体的生物合成和分泌来促进外泌体产生，研究人员首先在HEK-293T细胞中进行筛选，找到了增强外泌体产生的基因。具体来说，通过将nanoluc（nluc）（一种小而有效的生物发光报告基因）融合到CD63的C端（最广泛使用的外泌体标志之一）来制备报告系统。该报告基因与编码增强外泌体生产候选物的质粒共转染，逐步离心去除掩蔽信号后测量细胞培养上清液中的发光。研究人员鉴定了STEAP3（参与外泌体生物合成）、syndecan-4（SDC4;支持内体膜形成多泡体的出芽）和L-天冬氨酸氧化酶片段（NadB;可能通过调节柠檬酸循环促进细胞代谢）作为潜在的合成外泌体生产促进剂。这些基因的组合表达显著增加了外泌体产生，确保转染细胞以固定比例接受所有增强基因的三顺反子质粒载体（pDB60，以下称为外泌体生产增强剂）使上清液中的发光信号产生了15-40倍的增加（取决于细胞条件）。大部分发光信号来源于囊泡相关CD63-nluc，而不是来自可溶性nluc。研究人员还通过使用另一个报告分子CD9-nluc证实了加强因子的作用，表明加强剂对不同亚群外泌体的功效。此外，通过直接定量外泌体蛋白CD9和TSG101证实了外泌体生产的促进作用。最重要的是，纳米颗粒追踪分析（NTA）显示在不改变其大小分布的情况下，外泌体产量显著增加。总之，该方法有效地增加了外泌体的产生。

在建立了高效、稳定的促进外泌体产生的方法后，研究人员开发了一种将特定RNAs包装到外泌体（RNA包装装置）和一种帮助RNA输送到靶细胞胞浆中的装置（胞质输送辅助物）。对于RNA包装装置，我们关注。研究人员将与C/Dbox RNA结构结合的古细菌核糖体蛋白L7Ae与CD63的C端缀合，并将C/Dbox插入到报告基因的3'非翻译区（3'-UTR）中，通过3'-UTR区域L7Ae和C/Dbox之间的相互作用，编码报道蛋白nluc的转录物可以很好地整合进外泌体。作为一种潜在的细胞溶质传递辅助物，研究人员关注到间隙连接蛋白——connexin 43（Cx43），最近报道Cx43在外泌体中富集，以及通过形成六聚体通道增强外泌体到靶细胞的信息转移，并且存在持续活性的突变体S368A。将潜在的RNA包装装置和胞质传递辅助物与外泌体产生促进剂、编码在其3'-UTR中带有C/Dbox的nluc mRNA的报告系统、以及靶向模块RVG-Lamp2b一起共转染。据报道RVG-Lamp2b可通过与烟碱乙酰胆碱受体（CHRNA7）结合将外泌体靶向大脑。将含有设计外泌体的上清液（没有进一步浓缩外泌体）用于表达CHRNA7的HEK-293T细胞，在输送至靶细胞的nluc mRNA翻译后进行发光测定。结果显示，只有当所有组分都存在时才能检测到来自靶细胞的强烈发光，表明每个装置的功能。来自外泌体产生细胞的培养上清液在去除外泌体后发光显著降低，表明信号确实通过外泌体的转移而产生。C/Dbox重复次数显著影响传递效率（特别是在没有C/Dbox的情况下几乎检测不到发光）。而且，具有持续活性的Cx43 S368A突变体是比野生型Cx43更有效的胞质传递辅助物。至此，已经确定并开发了有效的基于外泌体的细胞间通信所需的组件，并将它们命名为EXOtic装置。

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