外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 有囊泡相关技术问题请在该贴留言！ [打印本页]
作者: hzangs    时间: 2018-7-6 20:02
标题: 有囊泡相关技术问题请在该贴留言！
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hzangs最近几个月比较忙，没时间逐一阅读大家发的帖子。 有什么问题的话可以在这个帖子留言。如果是我之前没有总结过的问题，我看到后会回复。
作者: 奥比克    时间: 2018-7-7 20:11
想知道有没有PKH67跟踪外泌体的Protocol，谢谢hzangs大神
作者: hjj    时间: 2018-7-9 15:08
您好，想请问一下，外泌体载药的话，浓度怎么确定呢？老师能推荐一些外泌体载药的文献吗？？
作者: hzangs    时间: 2018-7-9 20:36
奥比克 发表于 2018-7-7 20:11
想知道有没有PKH67跟踪外泌体的Protocol，谢谢hzangs大神

这个没有。。。   大概的方法在论坛里之前就讨论过。 一般是先和纯化好的外泌体共孵育，然后再重新从体系中纯化外泌体，在于你的受体细胞共孵育。    里面没什么太多的难度，基本没有整理过protocol
作者: hzangs    时间: 2018-7-9 20:37
hjj 发表于 2018-7-9 15:08
您好，想请问一下，外泌体载药的话，浓度怎么确定呢？老师能推荐一些外泌体载药的文献吗？？ ...

如果这个浓度能查出来，你的工作量就没多少了。 载药浓度不同的药、不同的来源的外泌体、不同的负载方法都不一样。 这个需要你自己去读十几篇paper  然后好好规划一下，设置不同的梯度 然后寻找一个合适浓度。
作者: lictic    时间: 2018-7-9 21:49
请问是否每次提外泌体都需要测浓度？同种细胞系每次提取的外泌体蛋白量变化大吗？能否通过毫升数、皿数进行估算
作者: yunyu    时间: 2018-7-10 09:16
hzangs老师，我们在做5%，10%，20%，40%的OptiPrep梯度，离心100000*18h，但做出来杂ALIX带很弥散，在每层里都有。想问一下做OptiPrep梯度是要跟蔗糖梯度一样做好之后过夜等蔗糖自由扩散么?还是有啥其他问题
作者: hzangs    时间: 2018-7-10 09:42
lictic 发表于 2018-7-9 21:49
请问是否每次提外泌体都需要测浓度？同种细胞系每次提取的外泌体蛋白量变化大吗？能否通过毫升数、皿数进行 ...

每次测浓度。
作者: hzangs    时间: 2018-7-10 09:44
yunyu 发表于 2018-7-10 09:16
hzangs老师，我们在做5%，10%，20%，40%的OptiPrep梯度，离心100000*18h，但做出来杂ALIX带很弥散，在每层 ...

没有试过optiprep，  不建议以wb的结果来评判实验的成败。 ALIX这种蛋白只是在外泌体里富集，并非只存在于外泌体中。 以电镜结果为准~~
作者: yazisummer    时间: 2018-7-11 10:29
hzangs大神!
我用原代培养的细胞，无FBS培养基饥饿48小时后，收取上清，4度存放了两天。20，000g 4度离心20min,    10,000g 4度离心30min后，100，000g 4度离心2h后未有可见沉淀。 去上清加PBS后100，000g 4度离心1h未见可见沉淀。
加150ulpbs冲洗管底和壁，直接去此溶液未裂解BCA测浓度。浓度跟空白一样。
谢谢hzangs大神指教，看看我的问题出在哪里？
作者: hzangs    时间: 2018-7-11 15:42
yazisummer 发表于 2018-7-11 10:29
hzangs大神!
我用原代培养的细胞，无FBS培养基饥饿48小时后，收取上清，4度存放了两天。20，000g 4度离心20 ...

强调好多遍了……    这种问题我真不想再回答了…… 最后一次……

原代细胞本来分泌量就低，所以起始培养细胞量要大，起始体积至少要按百毫升算，100没有就200。   超离结束 上清不要倒， 吸走，底部留一点培液。  最好用水平转，不要用角转。  看不到沉淀没关系，只要检测有蛋白浓度  跑wb有条带  电镜有结构  NTA符合就行了。
作者: Megan    时间: 2018-7-17 15:15
大神，想请问下外泌体提取microRNA的具体protocol，后期荧光定量PCR用什么内参比较好操作啊
作者: hzangs    时间: 2018-7-18 10:13
Megan 发表于 2018-7-17 15:15
大神，想请问下外泌体提取microRNA的具体protocol，后期荧光定量PCR用什么内参比较好操作啊 ...

论坛和公众号里很多。自己找。 不再赘述
作者: pfdsj    时间: 2018-7-18 17:42
您在初识外泌五，有提到抽提外泌体用TAKARA的9094，我也用了，之前咨询过技术，他们回复得到水相之后按照说明书加无水乙醇沉淀RNA, 您在文章中提到是在水相中加两个添加剂之后，按通常的做法加异丙醇沉淀，不按说明书而是加异丙醇的效果会更好？
作者: hzangs    时间: 2018-7-22 22:17
pfdsj 发表于 2018-7-18 17:42
您在初识外泌五，有提到抽提外泌体用TAKARA的9094，我也用了，之前咨询过技术，他们回复得到水相之后按照说 ...

说明书里是沉淀DNA的。 咱们是要抽提RNA，能一样么亲    请按照我的方法来！
作者: angma    时间: 2018-8-29 06:10
初入外泌体，常在文献中看到用多少浓度的外泌体treat， 或者收获后测得外泌体浓度是多少，想问下这个浓度是怎么测得的呢？怎么知道我的样本离心或者使用kit提取之后的外泌体浓度是多少。搜索了半天总是找不到关键的答案，希望能得到您的解答，谢谢！
作者: nixiao    时间: 2018-9-12 20:38
您好，我是细胞上清提外泌体，想看两个细胞共培养后，有没有特殊因子的上调，除了做外泌体的蛋白组学还能不能用离心后上清提的蛋白再做蛋白组学呢？大神，你知道有没有人这样做过呢？
作者: hzangs    时间: 2018-9-12 23:50
nixiao 发表于 2018-9-12 20:38
您好，我是细胞上清提外泌体，想看两个细胞共培养后，有没有特殊因子的上调，除了做外泌体的蛋白组学还能不 ...

你只是想看分泌组有没有变化。  直接沉淀所有的胞外蛋白就可以。 如果特异性的想看外泌体中是否有因子变化 才需要做外泌体的蛋白质组学。
作者: z6234206    时间: 2018-11-9 20:36
请问，提取完外泌体后，需要用多少浓度处理细胞？如何处理，是直接将外泌体添加到待处理的细胞上清液中么
作者: hzangs    时间: 2018-11-23 11:39
z6234206 发表于 2018-11-9 20:36
请问，提取完外泌体后，需要用多少浓度处理细胞？如何处理，是直接将外泌体添加到待处理的细胞上清液中么 ...

不同细胞 不同功能研究不一样。  你需要自己去摸索
作者: danielle    时间: 2019-7-29 15:58
我发现我在1 ml PBS里加3-4 ul tween20，再上NTA测量，发现有很高浓度的颗粒，粒径可能小于100 nm，你们有人遇到过这个情况吗？这件事情的起因是我加了15% tween-20破坏外泌体后，稀释后上NTA，发现颗粒浓度还升高了。
作者: psyerLD    时间: 2019-11-19 13:26
Hzangs老师，有几个问题想请教您，万分感谢！！
1.外泌体做电镜的话需要做冷冻电镜吗？
2.外泌体提取出来之后大概可以在-80保存多久还能保持活性？如果提取出来先在4°放置两天再放到-80保存会会电镜或NTA鉴定有影响吗？
3，我用含有5%血清替代物的400ml细胞上清液提取外泌体，最后用100ulPBS重悬，检测NTA发现一点囊泡都没有，但是第一次同样的方法提取出来的200ml不含血清替代物的细胞上清，50u重悬后可以检测出来大约10的7次方个囊泡数，会是因为血清替代物的影响吗？
作者: hzangs    时间: 2019-11-19 13:51
psyerLD 发表于 2019-11-19 13:26
Hzangs老师，有几个问题想请教您，万分感谢！！
1.外泌体做电镜的话需要做冷冻电镜吗？
2.外泌体提取出来之 ...

1、 负染即可。如果有条件 冷冻电镜也OK
2、-80可以长期保存，几个月没问题。 冷冻过的样品 可能会存在抱团   粒径增大等情况。
3、不是，大概率你都收丢了。 一般检测的囊泡数目 应该在10^9左右。你这比大家的数据低了2个数量级
作者: psyerLD    时间: 2019-11-19 14:52
hzangs 发表于 2019-11-19 13:51
1、 负染即可。如果有条件 冷冻电镜也OK
2、-80可以长期保存，几个月没问题。 冷冻过的样品 可能会存在抱 ...

谢谢hzangs老师！！我看了您在杭州的那个课件，里面写了超离最后一步不要倒出上清，意思就是这一步操作的时候我用移液管将上清吸走吗？
作者: hzangs    时间: 2019-11-19 18:54
psyerLD 发表于 2019-11-19 14:52
谢谢hzangs老师！！我看了您在杭州的那个课件，里面写了超离最后一步不要倒出上清，意思就是这一步操作的 ...

是的，
作者: 18331131398    时间: 2019-11-20 09:05
hzang老师您好，我想问一下，我是用植物提取的外泌体，一直没找到鉴定蛋白的marker,只做了电镜和NTA，不知道蛋白这块该怎么鉴定，希望老师指导下
作者: hzangs    时间: 2019-11-20 09:57
18331131398 发表于 2019-11-20 09:05
hzang老师您好，我想问一下，我是用植物提取的外泌体，一直没找到鉴定蛋白的marker,只做了电镜和NTA，不知 ...

植物方面，我关注的很少。一般认为  植物方面释放的 只能叫做囊泡，不叫外泌体。 你可以参考一下相关的文章  看看他们怎么鉴定的。  植物蛋白跑WB  比较难， 如果其他论文也没有WB鉴定，你可以考虑不做这个实验。
作者: 18331131398    时间: 2019-11-20 16:29
hzangs 发表于 2019-11-20 09:57
植物方面，我关注的很少。一般认为  植物方面释放的 只能叫做囊泡，不叫外泌体。 你可以参考一下相关的文 ...

好的，谢谢老师
作者: psyerLD    时间: 2019-11-20 18:55
hzangs 发表于 2019-11-19 18:54
是的，

好的！谢谢大神！
作者: hollychao    时间: 2019-12-1 17:30
hzangs大神好！我的实验是比较提出来的外泌体内的蛋白含量差异，用Elisa来做，想请问hzangs大神，
1.在elisa前用什么来裂解外泌体比较好呢？用M-PER还是RIPA加蛋白酶抑制剂呢？我是小白所以不太懂
2.用试剂盒提出来的外泌体肯定会有杂蛋白存在，我怎样确保杂蛋白不会影响后面的elisa结果呢？是不是使用蛋白酶k？
谢谢！
作者: hzangs    时间: 2019-12-3 09:49
1. 用什么裂解，取决于你的实验，RIPA能搞定就 RIPA， 不能  就换。 2.如果你研究的是囊泡内蛋白，那么 蛋白酶K  是可以的
作者: hollychao    时间: 2019-12-3 22:27
hzangs 发表于 2019-12-3 09:49
1. 用什么裂解，取决于你的实验，RIPA能搞定就 RIPA， 不能  就换。 2.如果你研究的是囊泡内蛋白，那么 蛋 ...

谢谢hzangs大神的回复！跟着大神学习~
作者: sammyml    时间: 2019-12-3 23:21
请问大大 有没有可以查询肿瘤和正常人外泌体某个蛋白质表达量高低的数据库呀
作者: hzangs    时间: 2019-12-4 10:11
sammyml 发表于 2019-12-3 23:21
请问大大 有没有可以查询肿瘤和正常人外泌体某个蛋白质表达量高低的数据库呀 ...

这样的数据库 目前还不完善。 RNA库相对比较完善。  这几个数据库 供你参考

http://www.exorbase.org/
http://microvesicles.org/index.html
http://www.exocarta.org/
https://exrna.org/
作者: liulin625    时间: 2020-1-10 12:53
您好，请教下SBI Exoquick TC 试剂盒提取外泌体的相关问题。

小鼠乳腺癌EMT6 cell line，正常培养48小时后换成Exo-free 的10%FBS培养基，培养48-72小时后收集上清，提取外泌体。
1 Collect cell culture medium
2 300g 5min, 2000g 20min
3 Collect the supernatant and pass through 0.22um filter membrane
4 Ultrafiltration tube 100kDa, supernatant 15ml, 4000g 30min, 4 centigrade.
6 Collect the residual liquid on the upper part, about 200ul.
7 Add the Exoquick reagent with the ratio (sample Vs reagent, 5 Vs 1), then inverting or flicking the tube.
8 Incubate overnight, about 16 hours under 4 centigrade
9 Centrifuge 10000g 30min.
10 Collect the pellet and resuspend with PBS.
通常，按网上资料显示，试剂盒提取的外泌体会产生大量沉淀，按此操作后，最终未见沉淀出现，细胞量大概5x107。想请您帮忙分析下原因，不知您是否提取过EMT6细胞系的外泌体，可能是细胞系的原因么，还是实验方案的问题，小鼠的外泌体会和人类的大小存在差别么。谢谢
作者: hzangs    时间: 2020-1-13 09:59
liulin625 发表于 2020-1-10 12:53
您好，请教下SBI Exoquick TC 试剂盒提取外泌体的相关问题。

小鼠乳腺癌EMT6 cell line，正常培养48小时后 ...

方法和起始量问题都不大。  看不出有什么问题。 请直接咨询相关试剂盒的技术支持人员。分析是否试剂盒自身存在问题。
作者: liulin625    时间: 2020-1-14 12:28
好的，谢谢，张老师，会不会存在小鼠细胞系外泌体的大小与人的不一样的可能性？
作者: hzangs    时间: 2020-1-15 11:48
liulin625 发表于 2020-1-14 12:28
好的，谢谢，张老师，会不会存在小鼠细胞系外泌体的大小与人的不一样的可能性？ ...

5000万小鼠细胞， 这个量对 基于聚合物沉淀 的试剂盒来说， 不少了
作者: hzangs    时间: 2020-1-15 11:49
liulin625 发表于 2020-1-14 12:28
好的，谢谢，张老师，会不会存在小鼠细胞系外泌体的大小与人的不一样的可能性？ ...

大小上  不存在那么大的差别。
作者: Mr-summerr    时间: 2020-1-16 14:42
hzangs老师你好，想请教下既然去年那篇文献Reassessment of Exosome Composition证明dsDNA是直接排到细胞外的，不存在于外泌体中。那没有膜的结构的颗粒是不是只能叫细胞外颗粒了，连extracellular vesicles都不算
作者: 仙逆清水    时间: 2020-1-18 17:04
各位前辈好，有个外泌体LncRNA验证的问题想咨询一下，由于外泌体测序的时候用光了两个样本RNA，现在qPCR验证的时候就少了两个样本，请问这时候能用其他的样本替代吗
作者: hzangs    时间: 2020-1-21 10:15
Mr-summerr 发表于 2020-1-16 14:42
hzangs老师你好，想请教下既然去年那篇文献Reassessment of Exosome Composition证明dsDNA是直接排到细胞外 ...

去年那篇文章只能说  DNA可能不在囊泡中。  如果你关注一下这个领域就会发现，前段时间 又出了一篇大文章。  介绍 肿瘤来源的外泌体  确实会有大约10%左右 携带有DNA。
作者: hzangs    时间: 2020-1-21 10:16
仙逆清水 发表于 2020-1-18 17:04
各位前辈好，有个外泌体LncRNA验证的问题想咨询一下，由于外泌体测序的时候用光了两个样本RNA，现在qPCR验 ...

如果是细胞系的话  还好。 再收一次外泌体，测qPCR 能部分说明问题。  如果是人样本的话   那就不好办了
作者: 骑在银龙背上    时间: 2020-1-21 15:37
请问用qiagen的exoEasy试剂盒提取的外泌体直接共孵育好像因为XE洗脱液的问题对细胞有损伤，用什么办法能将外泌体置换到PBS中呢？
作者: changlong    时间: 2020-2-1 17:27
冻存3-5年的血清样本提外泌体的效果怎么样呢，谢谢
作者: hzangs    时间: 2020-2-2 08:17
骑在银龙背上 发表于 2020-1-21 15:37
请问用qiagen的exoEasy试剂盒提取的外泌体直接共孵育好像因为XE洗脱液的问题对细胞有损伤，用什么办法能将 ...

这个问 他们的技术人员。  我们没有进行过相关尝试
作者: hzangs    时间: 2020-2-2 08:18
changlong 发表于 2020-2-1 17:27
冻存3-5年的血清样本提外泌体的效果怎么样呢，谢谢

只要没反复冻融过， 基本不会有什么问题。
作者: 仙逆清水    时间: 2020-2-3 19:46
hzangs 发表于 2020-1-21 10:16
如果是细胞系的话  还好。 再收一次外泌体，测qPCR 能部分说明问题。  如果是人样本的话   那就不好办了 ...

老师 你好  我用的是人类尿液样本，那两个样本用完后，现在只能用别的样本来代替，不知道这样行不行
作者: hollychao    时间: 2020-6-9 20:44
请教hzangs大神~做ELISA测外泌体内的蛋白之前，是样本（外泌体悬浮液）和RIPA=1：1来裂解外泌体的吗的吗？裂解后需不需要离心取上清液呢？非常感谢~
作者: hzangs    时间: 2020-6-11 15:24
hollychao 发表于 2020-6-9 20:44
请教hzangs大神~做ELISA测外泌体内的蛋白之前，是样本（外泌体悬浮液）和RIPA=1：1来裂解外泌体的吗的吗？ ...

抱歉，这个真没做过。 但是按照你的描述来说， 没什么问题，你可以按照细胞质中蛋白的 ELISA 方法 来操作
。
作者: hollychao    时间: 2020-6-14 22:22
hzangs 发表于 2020-6-11 15:24
抱歉，这个真没做过。 但是按照你的描述来说， 没什么问题，你可以按照细胞质中蛋白的 ELISA 方法 来操作 ...

好哒~谢谢大神~~
作者: ypf123    时间: 2020-7-9 18:23
我想问一下，什么细胞提取的外泌体的量比较多
作者: liulin625    时间: 2020-10-10 11:51
最近准备从血浆中提取外泌体，有qEv和蔗糖垫两种备选方案，不知版主有什么推荐，是否可以分享下提取方法，蔗糖垫一定要重水配置么，有人说PBS也可以，求大家指导，谢谢
作者: hzangs    时间: 2020-10-11 12:54
liulin625 发表于 2020-10-10 11:51
最近准备从血浆中提取外泌体，有qEv和蔗糖垫两种备选方案，不知版主有什么推荐，是否可以分享下提取方法， ...

目前血浆中提取细胞外囊泡的主流做法 是密度梯度离心（蔗糖垫 是简化的密度梯度离心策略）
作者: future1994    时间: 2020-12-13 10:52
您好hzangs大神，最近尝试用梯度密度离心提取血浆中外泌体，用的贝克曼的水平转子，第一遍超速离心后可以看到管底有胶冻样沉淀，我官底就留了大约300ul左右，加上PBS重悬后第二遍基本看不见了，这一步上清需要去除干净吗？
我之前两部超离后上清都送的很干净，去做了电镜，什么都没找到，请问应该先做什么NTA还是TEM呢
作者: hzangs    时间: 2020-12-14 09:46
future1994 发表于 2020-12-13 10:52
您好hzangs大神，最近尝试用梯度密度离心提取血浆中外泌体，用的贝克曼的水平转子，第一遍超速离心后可以看 ...

密度梯度离心，需要回收特定密度区段…   未必是在管底，这和你配置的密度梯度有关…  详情 查阅thery 在2006年发表的protocol
作者: future1994    时间: 2020-12-17 13:45
hzangs 发表于 2020-12-14 09:46
密度梯度离心，需要回收特定密度区段…   未必是在管底，这和你配置的密度梯度有关…  详情 查阅thery 在 ...

不好意思，hzangs前辈，我说错了，是在用超速离心提取血浆来源外泌体，因为我们实验室只有水平转子，所以沉淀是在管底，这几次看到了在管底有些油状或胶冻样沉淀，但是贴壁不牢固，可以随液面有晃动，我就留了一些，后来用PBS重悬后再超速离心就什么都看不到了。离心完我就把所有上清都去掉了，用50~100ulPBS重悬，但是BCA结果也就在0.8ug/ul(每管是2ml血浆)，做了一次电镜也没看到，请问整个操作过程有什么需要改进的地方吗，谢谢大神老师！
作者: hzangs    时间: 2020-12-18 22:04
future1994 发表于 2020-12-17 13:45
不好意思，hzangs前辈，我说错了，是在用超速离心提取血浆来源外泌体，因为我们实验室只有水平转子，所以 ...

血浆中的细胞外囊泡分离纯化， 单纯使用一种策略进行分离，基本都不会很成功。 建议你考虑超速离心+凝胶排阻层析试试。
作者: yangduoduo0311    时间: 2020-12-22 09:04
hzangs大神，你好，最近在造动物模型，要用GW4869抑制外泌体 ，找了问多文献，想咨询一下，外泌体抑制的动物浓度是多少，是1.25mg/kg吗？？？我看到好多文献里面写的是这个浓度..求大神翻牌子！！！
作者: future1994    时间: 2020-12-22 22:26
hzangs 发表于 2020-12-18 22:04
血浆中的细胞外囊泡分离纯化， 单纯使用一种策略进行分离，基本都不会很成功。 建议你考虑超速离心+凝胶 ...

哦哦，谢谢大神，我再查一下
作者: MMM    时间: 2021-1-8 18:42
hzangs 发表于 2020-2-2 08:18
只要没反复冻融过， 基本不会有什么问题。

请问 人血清-80冻存 提取MVs 是25度解冻还是4度解冻好一些
作者: zhouziheng    时间: 2022-5-28 21:26
标题: نوع الخيار الثنائي طراد
hzangs ??? 2020-1-15 11:48
5000?????, ???? ??????? ??????, ???

https://enjazalkhaleej.com/كيف-يتم-تحديد-قيمة-العملة/
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http://marebradio.com/من-كان-اول-رئيس-للاتحاد-السوفياتي/
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https://advocatesnairobi.com/موقع-العرب-مباشر-فن/
作者: 15350735509@163    时间: 2022-6-28 20:57
hzangs老师  我刚接触外泌体  1. 打算用SBI公司kit 提取血液肿瘤细胞上清外泌体   您有经验大概需要多少细胞上清吗？2.同样是SBI公司kit  从血浆提取外泌体  初始量大概用多少 ？  后续打算跑western鉴定外泌体    及从外泌体中提取RNA   跑三个miRNA Q-PCR。3.做Q-PCR时  打算trizol提取总RNA   U6做内参，ABI公司的kit     
作者: 15350735509@163    时间: 2022-6-29 09:27
无FBS培养基大家用的哪一家？我看有文章研究刺激外泌体分泌的物理  化学因素，可以用点刺激细胞多分泌一些外泌体吗
作者: chuanchuan    时间: 2023-2-22 17:37
请问有没有什么方法可以让已经提取的外泌体在体外实验中加入培养基且不进入细胞？



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