Blood：急性胸部综合症期间分离的循环外泌体破坏内皮完整性 - 外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

急性胸部综合征（ACS）是镰状细胞病（SCD）患儿发病和死亡的主要原因。内皮的异常细胞-细胞相互作用是ACS病理生理学的核心。内皮细胞完整性受循环细胞-细胞外囊泡（外泌体）的部分调节。之前已经证明（即使在健康基线时）患有SCD的患者的循环外泌体数量增加，并且来自具有ACS病史的SCD患者的外泌体加剧体外内皮完整性的破坏。这项研究旨在检验这样的假设，即在ACS发作期间从患者体内分离的外泌体会比在基线时从同一患者中分离的外泌体对内皮细胞产生更大的内皮损伤。

研究人员确定了9名患有SCD的患者，这些患者在基线时和ACS入院时（输血前）分离血浆。如果患者自输血后超过4周并且没有新的健康相关疾病，则样本被认为是基线。ACS的定义是胸部X线检查有浸润，伴有发烧、疼痛、缺氧或咳嗽。从没有SCD或已知医学问题且BMI<95％的儿童获得对照血浆样品。使用已建立的方法从血浆中分离外泌体。通过纳米颗粒跟踪分析进行囊泡大小的评估。为了确定对内皮的影响，将外泌体添加到人微血管内皮细胞（HMVEC）的培养物中，随后通过荧光显微镜研究（在VE-钙粘蛋白免疫定位后，与TRITC-缀合的鬼笔环肽反应和用DAPI处理）。通过免疫印迹检测和定量外泌体和细胞的蛋白质组分。通过qRT-PCR测定VE-钙粘蛋白mRNA表达。使用比色测定法定量游离血红素。

纳米颗粒跟踪分析显示，所有外泌体样本（无论患者或疾病状态如何）具有类似的大小分布，具有90-100nm的尖峰。免疫印迹显示所有样品中存在外泌体标记蛋白（CD63和flotillin）。在ACS期间获得的样品中，这些蛋白质的丰度增加了50％（平均）。免疫印迹显示外泌体还含有血红蛋白、血型糖蛋白A和铁蛋白；其中，SCD患者（SCD患者比对照组高2倍）和ACS患者（ACS比对照组高4倍）血红蛋白增加。外泌体样本中的血红素浓度低于测定检测限。显微镜检查显示外泌体在内皮单层上的应用不会立即造成损害；此外，大多数样品在24小时后没有显示出明显的损伤。然而，48小时后，ACS-外泌体引起VE-钙粘蛋白（细胞间隙开放）和肌动蛋白微丝（通过鬼笔环肽染色检测）的定位改变，与细胞回缩现象一致。ACS外泌体引起的单层细胞破坏明显多于基线外泌体（基线：0.36±0.07％无细胞空间对比ACS：5.81±0.65％无细胞空间，p<0.01）。 DAPI染色显示除细胞死亡或脱离之外的细胞核数量没有差异。虽然VE-钙粘蛋白mRNA水平没有变化，但在用ACS-外泌体与基线-外泌体处理的细胞中，免疫印迹显示VE-钙粘蛋白蛋白显著降低（62％）（p <0.01）。

这些结果证实并延伸了之前的观察结果，即SCD患者中的外泌体循环影响内皮完整性。它们的组成显示一些外泌体来自红细胞前体，但它们不仅仅是红细胞衍生的囊泡。ACS外泌体引起内皮单层完整性的破坏，涉及肌动蛋白细胞骨架的重排和基于钙粘蛋白的细胞间连接的降解。时程实验表明它需要细胞信号传导，也许还需要新的RNA /蛋白质合成。因此推测外泌体是所有SCD患者血管病变的核心。

Gabrielle Lapping-Carr, Joanna Gemel, Yifan Mao, Gianna Sparks, Margaret Harrington, Rebecca Sturey, Shelby Gruntorad, Wendy S Darlington, Radhika Peddinti and Eric C. Beyer. Circulating Exosomes Isolated during Acute Chest Syndrome Disrupt Endothelial Integrity. Blood 2018 132:2363; doi: https://doi.org/10.1182/blood-2018-99-111907

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