外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 血清外泌体抽提方法y [打印本页]
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-3 10:03
标题: 血清外泌体抽提方法y
除了超速离心和密度梯度离心外，就只能用试剂盒提取了，大家有谁知道试剂盒提取的原理是什么呢，用哪些试剂可以代替试剂盒呢，即使产量跟纯度差一点也没关系。
作者: chyi    时间: 2015-8-3 20:42
顶，我也想知道
作者: 惜名    时间: 2015-8-4 09:18
所有方法在这张帖子都有罗列：http://www.exosome.com.cn/forum. ... p;extra=&page=1
题主，life、SBI、101bio的试剂盒我们都算过价格了，都不便宜。。。
这个课题目前就是这样烧钱的状态，超离得率低，需要耗费大量培养基
如果贵实验室这点钱都无法支撑，我劝还是赶紧转方向吧
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-5 08:52
Johnny 发表于 2015-8-4 18:01
一哥常逛我们论坛哈

欢迎欢迎

当然是降低成本了，不受试剂盒的限制。
作者: chyi    时间: 2015-8-5 08:53
Johnny 发表于 2015-8-4 18:01
一哥常逛我们论坛哈

欢迎欢迎

  觉得问题不错，顶一下
作者: zhuyiping    时间: 2015-8-5 16:07
  1.For the isolation of exosomes from human umbilical cord Wharton’s jelly-MSCs and human dermal fibroblasts, serum-free culture medium conditioned for 24 hours was filtered (0.2 m) and concentrated by ultrafiltration device with 100-kDa cutoff (Millipore).
   2.Exosomes in CM were precipitated with one-third volume of polyethylene glycol buffer (33.4% PEG 4000, 50 mmol/L HEPES [pH 7.4], 1 mol/L NaCl) overnight at 4°C, followed by centrifugation at 12 000 g for 5 minutes and resuspension in PBS (pH 7.4).
   3.Exosomes in polyethylene glycol–precipitated fraction were further purified by S200 size-exclusion chromatography. A 75-L sample was applied on a S200 column (Clontech, Mountain View, CA)pre-equilibrated with PBS by spinning at 700 g for 5 minutes, and the exosomal fraction was subsequently eluted in the flow-through by
centrifugation at 700 g for 5 minutes.刚看的文献。
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-5 16:13
zhuyiping 发表于 2015-8-5 16:07
1.For the isolation of exosomes from human umbilical cord Wharton’s jelly-MSCs and human dermal f ...

非常感谢，明天我试试，看看效果。
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-5 16:18
zhuyiping 发表于 2015-8-5 16:07
1.For the isolation of exosomes from human umbilical cord Wharton’s jelly-MSCs and human dermal f ...

这篇文献能发我一份吗？464355399@qq.com
作者: mirexosome    时间: 2015-8-5 16:35
能给我一份吗
1.For the isolation of exosomes from human umbilical cord Wharton’s jelly-MSCs and human dermal f ...
，1040269617@qq.com,
发财楼主效果如何之后跟我们分享一下，谢谢
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-5 16:56
一定，相互学习，共同进步。
作者: 惜名    时间: 2015-8-6 10:22
围观~~期待效果  
作者: zhuyiping    时间: 2015-8-6 14:10
暮色恭喜发财 发表于 2015-8-5 16:18
这篇文献能发我一份吗？

http://circ.ahajournals.org/content/126/22/2601.long
作者: zhuyiping    时间: 2015-8-6 14:11
暮色恭喜发财 发表于 2015-8-5 16:18
这篇文献能发我一份吗？

http://circ.ahajournals.org/content/126/22/2601.long
作者: zhuyiping    时间: 2015-8-6 14:12
mirexosome 发表于 2015-8-5 16:35
能给我一份吗，,
发财楼主效果如何之后跟我们分享一下，谢谢

http://circ.ahajournals.org/content/126/22/2601.long  我这网速太慢自己下吧
作者: zhuyiping    时间: 2015-8-6 14:13
mirexosome 发表于 2015-8-5 16:35
能给我一份吗，,
发财楼主效果如何之后跟我们分享一下，谢谢

http://circ.ahajournals.org/content/126/22/2601.long  我这网速太慢自己下吧
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-6 15:12
zhuyiping 发表于 2015-8-6 14:12
http://circ.ahajournals.org/content/126/22/2601.long  我这网速太慢自己下吧

收到，谢谢。
作者: zhuyiping    时间: 2015-8-7 10:18
For the application of PEG solutions to isolate exosomes from biofluids, several commercial products have been developed; the most commonly used and known is ExoQuick from System Biosciences.
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-7 13:41
zhuyiping 发表于 2015-8-7 10:18
For the application of PEG solutions to isolate exosomes from biofluids, several commercial products ...

我们就是用的SBI的，20ml的要11000，太贵。
作者: zhuyiping    时间: 2015-8-7 13:50
暮色恭喜发财 发表于 2015-8-7 13:41
我们就是用的SBI的，20ml的要11000，太贵。

意思是这个试剂盒原理就是PEG沉淀。PEG可以层析除去。
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-7 14:01
现在的主要问题是弄清楚是PEG多少好，还有就是在哪个缓冲液中好，还有就是PH值
作者: mirexosome    时间: 2015-8-8 23:02
1.        For the isolation of exosomes from human umbilical cord Wharton’s jelly-MSCs and human dermal fibroblasts, serum-free culture medium conditioned for 24 hours was filtered (0.2 m) and concentrated by ultrafiltration device with 100-kDa cutoff (Millipore).
   2.Exosomes in CM were precipitated with one-third volume of polyethylene glycol buffer (33.4% PEG 4000, 50 mmol/L HEPES [pH 7.4], 1 mol/L NaCl) overnight at 4°C, followed by centrifugation at 12 000 g for 5 minutes and resuspension in PBS (pH 7.4).
   3.Exosomes in polyethylene glycol–precipitated fraction were further purified by S200 size-exclusion chromatography. A 75-L sample was applied on a S200 column (Clontech, Mountain View, CA)pre-equilibrated with PBS by spinning at 700 g for 5 minutes, and the exosomal fraction was subsequently eluted in the flow-through by centrifugation at 700 g for 5 minutes.

楼主按zhuyiping的说法，去做的话，你上面的这些要用的东西怎么解决呢？有些压根毒不知道是什么
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-10 10:29
mirexosome 发表于 2015-8-8 23:02
1.        For the isolation of exosomes from human umbilical cord Wharton’s jelly-MSCs and human dermal fi ...

ultrafiltration device with 100-kDa cutoff (Millipore)，这就是一个浓缩管
PEG 4000, 50 mmol/L HEPES [pH 7.4]这些也是常用试剂呀
至于后续要不要纯化在看。
作者: mirexosome    时间: 2015-8-10 12:01
暮色恭喜发财 发表于 2015-8-10 10:29
ultrafiltration device with 100-kDa cutoff (Millipore)，这就是一个浓缩管
PEG 4000, 50 mmol/L HEP ...

好的，等你的结果
作者: mirexosome    时间: 2015-8-12 16:55
暮色恭喜发财 发表于 2015-8-7 14:01
现在的主要问题是弄清楚是PEG多少好，还有就是在哪个缓冲液中好，还有就是PH值 ...

楼主实验进行的怎么样，是否理想，请分享下……
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-13 11:23
mirexosome 发表于 2015-8-12 16:55
楼主实验进行的怎么样，是否理想，请分享下……

现在还在摸索条件，主要是抽提出来不好检测，沉淀是有的，看表型还可以
作者: mirexosome    时间: 2015-8-14 10:12
暮色恭喜发财 发表于 2015-8-13 11:23
现在还在摸索条件，主要是抽提出来不好检测，沉淀是有的，看表型还可以 ...

不好检测是什么意思?有表型是指在扫描电镜下看得到exosome吗？
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-14 10:18
mirexosome 发表于 2015-8-14 10:12
不好检测是什么意思?有表型是指在扫描电镜下看得到exosome吗？

我们看到了沉淀，但不知道我们检测到的是是什么，准备用试剂盒来检测，有结果我在公布
作者: jianwen    时间: 2015-8-15 22:08
本帖最后由 jianwen 于 2015-8-15 23:58 编辑
暮色恭喜发财 发表于 2015-8-7 13:41
我们就是用的SBI的，20ml的要11000，太贵。
请问一下你是用多少血清分离外泌体，我是打算做miRNA芯片的
作者: 暮色恭喜发财    时间: 2015-8-17 09:07
我们现在用的跟试剂盒是一样的，250ul或者500ul.
作者: evomicscience    时间: 2015-10-24 23:12
Peg 4000 至20000，终浓度5-10%都可以。用它分离血清exosome会有很多问题。



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