王晓东院士组：外泌体释放途径参与调控细胞坏死性凋亡 - 外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

在坏死性凋亡的细胞中，假激酶MLKL被磷酸化从而能够破坏质膜。然而，磷酸化MLKL的出现并不总是导致坏死性凋亡，这促使王晓东课题组研究这种坏死性凋亡“刽子手”的活性是如何被抑制的。他们发现磷酸化的MLKL可能被flotillin-1和flotillin-2导入脂筏，随后进入溶酶体。此外，磷酸化的MLKL可通过依赖于ESCRT蛋白ALIX和syntenin-1的外泌体从细胞中释放出去。这些机制可能是确保只有足够强度的信号才能诱导坏死性凋亡的保障措施。

坏死性凋亡是一种受调节的坏死，与包括阿尔茨海默病在内的各种人类疾病有关。坏死性凋亡需要假激酶MLKL在被激酶RIPK3磷酸化后从胞质溶胶转移到质膜。使用蛋白质交联，然后进行亲和纯化，研究人员在膜定位的MLKL免疫沉淀物中检测到脂筏相关蛋白flotillin-1和flotillin-2以及ESCRT相关蛋白ALIX和syntenin-1。通过flotillin介导的内吞作用随后溶酶体降解或ALIX-syntenin-1介导的胞吐作用从膜中除去磷酸化的MLKL。因此，在发生质膜破坏之前，经历坏死性凋亡的细胞需要克服这些独立的抑制机制。

响应于肿瘤坏死因子受体（TNFR）的激活，哺乳动物细胞可以激活多种信号传导途径，包括通过细胞凋亡或坏死导致细胞死亡的途径。如果凋亡拮抗剂Smac（也称为Diablo）的细胞抑制剂丰度高并且引起细胞凋亡的胱天蛋白酶-8的活性相对较低，则发生一种这样的坏死性细胞死亡——坏死性凋亡（necroptosis）。因此，通过组合TNFα、一种模拟Smac蛋白功能的小分子和泛半胱天冬酶抑制剂可以强有力地诱导坏死性凋亡。这种处理激活受体相互作用蛋白激酶RIPK1，然后RIPK1通过它们各自的RIP同型相互作用基序区域的相互作用募集相关激酶RIPK3，导致RIPK3活化。Ser227位点磷酸化而激活的RIPK3募集并磷酸化其底物——混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL），这是一种假激酶，通常将其假激酶结构域折叠成一种构象。RIPK3介导的位于其假激酶结构域的Thr357和Ser358处的MLKL的磷酸化减轻了假激酶结构域的抑制作用，从而允许活化的磷酸化MLKL寡聚化并从细胞质转移至膜（包括质膜）以引起膜崩解导致坏死。

在坏死性凋亡研究中存在的一个主要问题是，一旦磷酸化MLKL到达质膜，坏死细胞死亡是如何被执行和调节的。具有磷酸化模拟突变或缺乏抑制性C-末端假激酶结构域的纯化MLKL变体可以在体外有效地破坏含有带负电荷的磷脂的人造脂质体膜。因此，MLKL的N-末端螺旋束似乎具有内在的膜破坏活性。然而，与先前的报道一致，在坏死性凋亡诱导后观察到磷酸化MLKL，并且如果及时去除坏死性凋亡剂，细胞可以恢复。因此，在膜破裂发生之前，活性MLKL必须克服负调节剂。先前已有各种研究表明，ESCRT途径可以从经历坏死性凋亡的细胞中去除含磷酸化MLKL的膜囊泡，从而减弱这种细胞死亡过程。目前的研究表明，对抗磷酸化MLKL的坏死作用，它不是一个而是两个这样的调节途径。除了由MLKL相互作用的ALIX和syntenin-1介导的ESCRT介导的外泌体胞吐作用外，flotillin介导的胞吞作用随后溶酶体降解是另一种从质膜中去除磷酸化MLKL的主要途径。

研究人员相信磷酸-MLKL和flotillins以及上述ESCRT相关蛋白之间的相互作用不是由于在特定的膜结构（例如脂筏）上的共定位，而是由于特定的蛋白质-蛋白质相互作用。敲除flotillins与磷酸化MLKL的脂筏定位的丧失有关。此外，在flotillin-1的Leu380位点周围多个单个氨基酸残基变化导致磷酸-MLKL与flotillins的结合丧失和从坏死细胞中去除磷酸-MLKL的能力。此外，即使通过NSA处理阻止MLKL到达质膜时，ALIX和syntenin-1仍然与磷酸-MLKL共免疫沉淀（而flotillins没有）。然而，尽管数据提示了flotillins和磷酸化MLKL之间的直接相互作用，但作者承认，正式证据不包括在本研究中，可以通过使用这些蛋白质的纯化片段的体外结合测定来解决。

MLKL与这些上述蛋白质之间的关联都需要完整的MLKL的N-末端螺旋束。这种关联可以有效地干扰MLKL的膜破坏活性，并通过从膜上除去磷酸-MLKL来防止坏死性凋亡。鉴于坏死细胞死亡的后果，细胞已经进化出有效和冗余的监测系统以确保接收的任何死亡信号是真实信号并不罕见。此外，不同的细胞类型应该能够通过其多个监测系统设定其游离磷酸化MLKL的假阴性“耐受水平”。

因此，作者提出以下的坏死性凋亡模型：游离磷酸化MLKL积累到足够的水平，导致直接的膜破坏。要做到这一点，磷酸化MLKL必须首先克服这些先天的防御线，然后才能破坏质膜以驱动坏死性凋亡。该假设不排除MLKL与坏死性凋亡执行的结合配体的存在。通过消除由该研究鉴定的磷酸-MLKL相互作用蛋白可以促进寻找这些潜在的蛋白。

该研究观察到阿尔茨海默病患者锥体神经元细胞内囊泡中磷酸化MLKL与flotillins的共定位，以及阿尔茨海默病中坏死性凋亡的作用，可以说明这种防御机制如何在患病组织中起作用。最终可以通过这些机制来克服不必要的坏死性凋亡。

Weiliang Fan, Jia Guo, Beichen Gao, Wenbin Zhang, Liucong Ling, Tao Xu, Chenjie Pan, Lin Li, She Chen, Hua Wang, Jing Zhang, and Xiaodong Wang*. Flotillin-mediated endocytosis and ALIX-syntenin-1-mediated exocytosis protect the cell membrane from damage caused by necroptosis. Science Signaling 28 May 2019: Vol. 12, Issue 583, eaaw3423 DOI: 10.1126/scisignal.aaw3423

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