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标题: 提取的外泌体目的是用于总RNA提取，哪个品牌的试剂盒好..... [打印本页]
作者: Dnail    时间: 2015-8-4 11:10
标题: 提取的外泌体目的是用于总RNA提取，哪个品牌的试剂盒好.....
各位好，本人打算开展EXO RNA的相关工作，在版主“惜名”一篇帖子http://www.exosome.com.cn/forum. ... &extra=page%3D1比较几种提取方法，分离的EXO目的都是后期开展蛋白相关实验用的，我想问有没有兄弟姐妹用试剂盒分离EXO后接着提取总RNA ,哪个盒子好一些？  感谢    我看到目前关于EXO的盒子品牌主要有：SBI、101bio、Izon、life、Qiagen等
作者: 惜名    时间: 2015-8-4 11:43
本帖最后由 惜名 于 2015-8-4 11:45 编辑

我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步：用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后，后面的才可以称之为”后续功能研究“，目前比较流行的还是miRNA、而非蛋白。
因此，不少人提取exo后做miRNA芯片、找差异表达的miRNA、然后进一步做功能，最终证明exo可以通过某个miRNA完成某个作用。

当然，蛋白也是可以做的。
exosoem表面有蛋白，这些蛋白有些是marker，但也有一些具有功能，譬如有研究认为exo表面有AT1R、有TNF-a，可以直接与靶细胞上的配体结合发挥作用。
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获得exo后，怎样提取总RNA？
我做过一次，用101bio的配套试剂盒，但是效果不好。或许是因为我的exo量太少、或许是后面引物不好，总之跑qPCR的CT值很高，不忍直视（提取miRNA后我没测浓度）。。。
后来，我索性直接找公司做的，bioTNT，之前找他们做过elisa和蛋白芯片，觉得还不错，于是我提取了exo直接给他们，让他们帮我提miRNA、并且接着跑miRNA，效果还不错，部分miRNA的CT值很高、在30以上，也有几个在20以内（我跑了8个miRNA，从相关文献里选择出来的）。
遗憾的是，我没问他们提取完miRNA是否测了浓度、也没问他们用了什么试剂盒提取的miRNA。。。
作者: Dnail    时间: 2015-8-4 20:41
惜名 发表于 2015-8-4 11:43
我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步：用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后， ...

非常感谢惜名的详细回复，感谢!
作者: harevin    时间: 2015-8-27 13:02
惜名 发表于 2015-8-4 11:43
我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步：用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后， ...

1ml血中一般能提取多少exosomes RNA？
作者: 惜名    时间: 2015-8-27 16:38
harevin 发表于 2015-8-27 13:02
1ml血中一般能提取多少exosomes RNA？

不知道  没提过。。。
作者: kadak007    时间: 2015-9-14 17:07
惜名 发表于 2015-8-4 11:43
我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步：用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后， ...

惜名版主，以你现在的经验，能再谈谈这几个问题吗？
1、用多少量的exo，开始进行提取总RNA或miRNA的工作，比较合适？
2、有推荐的试剂盒吗？
谢谢~
作者: 惜名    时间: 2015-9-15 08:53
kadak007 发表于 2015-9-14 17:07
惜名版主，以你现在的经验，能再谈谈这几个问题吗？
1、用多少量的exo，开始进行提取总RNA或miRNA的工作 ...

exo里面的RNA，我只做过一次，并且效果不好。
后来，我就直接把exo沉淀送给公司，让他们帮我提RNA、逆转录然后跑PCR了。
我送了大约4ml上清提出来的exo（SBI法）。

这4ml上清是用VIVO无血清培养基培养的，树突状细胞（DC）
根据前面做的浓度测定，exo量估计在10ug左右~
前几天，经Johhny版主证实，DC的分泌能力的确比较强，大约是干细胞的5倍左右~
作者: kadak007    时间: 2015-9-15 09:48
惜名 发表于 2015-9-15 08:53
exo里面的RNA，我只做过一次，并且效果不好。
后来，我就直接把exo沉淀送给公司，让他们帮我提RNA、逆转 ...

谢谢惜名~
作者: kadak007    时间: 2015-9-18 16:59
惜名 发表于 2015-8-4 11:43
我是惜名。
“后期展开蛋白实验”事实上只是exo研究的第一步：用western鉴定exo表面marker。
鉴定完成后， ...

惜名版主，请教下实验设计的问题
我现在也是通过查文献找到10来个miRNA，订购引物，从exo中提取总miRNA，合成cDNA，pcr扩增后，看看效果怎样，看能否从中找出几种miRNA进行后续功能研究。

问题是，我的exo是单一的胰腺癌来源，需要另外用正常的胰腺组织作为对照吗？对照的目的是避免出现这种情况：通过PCR筛选出的miRNA其实在胰腺正常组织中也是高表达的。

因为这10来种miRNA都是通过特定研究方向的文献查找出的，能否有效避免没有对照的风险？版主，你怎么看？请指点下，谢谢~
作者: 惜名    时间: 2015-9-18 19:11
我个人觉得，对照组肯定要有啊。。。
有没有正常的胰腺细胞可以作为对照呢？
作者: kadak007    时间: 2015-9-18 20:32
惜名 发表于 2015-9-18 19:11
我个人觉得，对照组肯定要有啊。。。
有没有正常的胰腺细胞可以作为对照呢？ ...

不好弄啊。你当时检测那8个miRNA时，用的什么对照啊？
作者: 惜名    时间: 2015-9-18 21:00
kadak007 发表于 2015-9-18 20:32
不好弄啊。你当时检测那8个miRNA时，用的什么对照啊？

我做树突状细胞
这个细胞分为immature和mature状态
所以自然就有了对照。。。
作者: kadak007    时间: 2015-9-18 21:07
惜名 发表于 2015-9-18 21:00
我做树突状细胞
这个细胞分为immature和mature状态
所以自然就有了对照。。。 ...

哦，好吧，看来对照是省不了的 。。。
作者: wu1998    时间: 2024-5-19 10:43
harevin 发表于 2015-8-27 13:02
1ml血中一般能提取多少exosomes RNA？

细胞上清一般是0.1到0.4ug/ml  宇玫博给的数据



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