外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: PKH67染色 [打印本页]

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作者: 宋梦阳    时间: 2015-8-21 15:10
标题: PKH67染色
请问大家知道PKH67怎么染外泌体吗，我看了试剂说明书只有怎么染细胞的，不知道怎么染外泌体，而且Diluent C溶液每次用很多，不敢浪费

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作者: 惜名    时间: 2015-8-22 10:15


是时候亮出这篇文献了：Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy.

[attach]196[/attach]

这篇文献用1ml Diluent C稀释，为了省钱，我降低到了0.3-0.5ml；效果一样赞~

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作者: wenzhouzsl    时间: 2015-8-28 15:51

惜名 发表于 2015-8-22 10:15
是时候亮出这篇文献了：Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate ...

惜大师，您说“Diluent C 降到了0.3-0.5ml"，也就是说PKH降到了1.3-2ul，对不？请问您的exosome有没有定量？大概多少微克？

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作者: 惜名    时间: 2015-8-28 17:46

wenzhouzsl 发表于 2015-8-28 15:51
惜大师，您说“Diluent C 降到了0.3-0.5ml"，也就是说PKH降到了1.3-2ul，对不？请问您的exosome有没有定 ...

大师不敢当
PKH还是4ul。exo只定量过一次，刚开始做鉴定时定量的，后来做功能都没定量（太费）。根据刚开始做定量的估计，exo为10-20ug（溶解在100ul PBS里面）。

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作者: yy8651    时间: 2015-8-28 19:24

惜名 发表于 2015-8-28 17:46
大师不敢当
PKH还是4ul。exo只定量过一次，刚开始做鉴定时定量的，后来做功能都没定量（太费）。 ...

用什么方法定量？

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作者: 惜名    时间: 2015-8-29 09:06

yy8651 发表于 2015-8-28 19:24
用什么方法定量？

蛋白。

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作者: wooway    时间: 2015-9-16 14:23

惜名 发表于 2015-8-22 10:15
是时候亮出这篇文献了：Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate ...

我想请教下如果我这里没有超速离心机，可否染色后再用EXOquick提取外泌体呢？大家是否有做过

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作者: 惜名    时间: 2015-9-16 14:44

wooway 发表于 2015-9-16 14:23
我想请教下如果我这里没有超速离心机，可否染色后再用EXOquick提取外泌体呢？大家是否有做过 ...

可以。
我就是这么干的。

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作者: 巧露娜    时间: 2015-9-17 18:05

惜名 发表于 2015-9-16 14:44
可以。
我就是这么干的。

请问可以用EXOquick提取之后在染色吗

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作者: 惜名    时间: 2015-9-18 07:55

巧露娜 发表于 2015-9-17 18:05
请问可以用EXOquick提取之后在染色吗

可以啊。。。
提取方法和染色没关系的，随便你染前怎么提、染后怎么提。。

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作者: 巧露娜    时间: 2015-9-18 08:03

惜名 发表于 2015-9-18 07:55
可以啊。。。
提取方法和染色没关系的，随便你染前怎么提、染后怎么提。。 ...

请问你用的是那种提取方法啊，超离还是试剂盒啊，用浓缩后用试剂盒会不会提取到不是exosome的其他物质啊

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作者: 惜名    时间: 2015-9-18 08:08
我用SBI的试剂盒。
有时直接按照1：5加kit试剂，有时先用millipore滤器浓缩一下，然后再按1：5加kit试剂
离心后看到沉淀就是exosome了。
当然，会有一些其他蛋白杂质。。。

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作者: 巧露娜    时间: 2015-9-18 08:33
请问SBI公司有代理商吗，在网上都找不到的，谢谢

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作者: 惜名    时间: 2015-9-18 19:13

巧露娜 发表于 2015-9-18 08:33
请问SBI公司有代理商吗，在网上都找不到的，谢谢

国内是吉泰在代理，你可以去官网看看呢~
http://www.genetimes.com.cn/

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作者: 宋梦阳    时间: 2015-10-13 11:17

惜名 发表于 2015-8-22 10:15
是时候亮出这篇文献了：Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate ...

我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果也很好

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作者: 宋梦阳    时间: 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果也很好。如果大家想要具体方法的话可以找我要文献，很节省材料效果也很好！

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作者: pumc2015    时间: 2015-10-13 19:50

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

求具体操作步骤juzhihai@126.com

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作者: niceman1987    时间: 2015-10-13 21:27

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

你好，能否发我一份步骤，hujinlong02@126.com，谢谢

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作者: 宋梦阳    时间: 2015-10-16 15:37

pumc2015 发表于 2015-10-13 19:50
求具体操作步骤

EXO染色步骤，已发

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作者: 宋梦阳    时间: 2015-10-16 15:38

niceman1987 发表于 2015-10-13 21:27
你好，能否发我一份步骤，，谢谢

已发，注意查收。

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作者: wanghx_85    时间: 2015-10-17 23:11

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

求具体操作步骤，邮箱：wanghx1985@126.com，非常感谢！

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作者: hereissyk    时间: 2015-10-18 10:23

宋梦阳 发表于 2015-10-16 15:38
已发，注意查收。

同求一份，好人一生平安 hereissyk@qq.com

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作者: 熊胖    时间: 2015-10-20 09:51
同求一份，好人一生平安 15242265@qq.com

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作者: lyj0324nj    时间: 2015-11-9 15:21

宋梦阳 发表于 2015-10-16 15:37
EXO染色步骤，已发

你好，能发一份吗，lyj0324nj@163.com

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作者: Nichole0503    时间: 2015-11-11 10:31

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

同求染色文献。wen0503@sina.com

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-16 11:53

niceman1987 发表于 2015-10-13 21:27
你好，能否发我一份步骤，，谢谢

能否将宋梦阳童鞋发给您的EXO染色步骤发给我一份呢，一直未等到他的回复呢，谢谢，wanghx1985@126.com

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-16 11:58

惜名 发表于 2015-8-22 10:15
是时候亮出这篇文献了：Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate ...

惜名版主，请问没有超离机，用SBI试剂盒提取外泌体的话该怎么染色呢？没太明白大家的讨论呢，难道是先SBI试剂盒提取外泌体，然后用PKH67染色，然后再用SBI试剂盒重新提取一次么？求回复，谢谢

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作者: 惜名    时间: 2015-12-16 11:59

wanghx_85 发表于 2015-12-16 11:58
惜名版主，请问没有超离机，用SBI试剂盒提取外泌体的话该怎么染色呢？没太明白大家的讨论呢，难道是先SBI ...

对的，就是你说的步骤。

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-16 12:03

惜名 发表于 2015-9-16 14:44
可以。
我就是这么干的。

还有您说的染色后再用试剂盒提是什么意思啊？如果提取之前染的话不是染的细胞的细胞膜么？而外泌体不是要从细胞培养上清液中提取么？之前怎么染，然后再用SBI试剂盒提呢，期待您的指导，谢谢。

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作者: 惜名    时间: 2015-12-16 12:05

wanghx_85 发表于 2015-12-16 12:03
还有您说的染色后再用试剂盒提是什么意思啊？如果提取之前染的话不是染的细胞的细胞膜么？而外泌体不是要 ...

1、提取外泌体，用SBI的exoquick。
2、提取后按照那篇JCI的步骤染色PKH67，此时染的是exo
3、染色结束后，再次用SBI的exoquick提取exosome。

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-16 12:09

惜名 发表于 2015-12-16 12:05
1、提取外泌体，用SBI的exoquick。
2、提取后按照那篇JCI的步骤染色PKH67，此时染的是exo
3、染色结束后 ...

谢谢惜名版主，太感动了，没想到您秒回啊，能否再简单说下先染后提的方法，其实我就是想知道有没有省点儿SBI试剂的方法啊

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作者: 惜名    时间: 2015-12-16 12:12

wanghx_85 发表于 2015-12-16 12:09
谢谢惜名版主，太感动了，没想到您秒回啊，能否再简单说下先染后提的方法，其实我就是想知道有 ...

啊，省试剂啊，哈哈~
1、提取exo的时候可以先用Millipore的管子浓缩一下
2、用PKH67染色的时候，PBS-exo以及Dilute C都可以适当减量，后面加的BSA中和液也可以减量，把最后总的体积控制在0.6-1.0ml效果还是不错的。

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-16 22:54

惜名 发表于 2015-12-16 12:12
啊，省试剂啊，哈哈~
1、提取exo的时候可以先用Millipore的管子浓缩一下
2、用PKH67染色的时候，PBS-exo ...

跪谢惜名版主，非常感谢。

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作者: 惜名    时间: 2015-12-17 08:49

wanghx_85 发表于 2015-12-16 22:54
跪谢惜名版主，非常感谢。

不用谢

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-18 00:00

惜名 发表于 2015-12-17 08:49
不用谢

呼叫惜名版主，那个外泌体染色、重提、PBS重悬后，一般加多少ul至靶细胞中共培养呢？假设24孔板做的话，谢谢版主

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作者: 惜名    时间: 2015-12-18 08:44

wanghx_85 发表于 2015-12-18 00:00
呼叫惜名版主，那个外泌体染色、重提、PBS重悬后，一般加多少ul至靶细胞中共培养呢？假设24孔板做的话， ...

这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板，一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是，也要根据你获得exo的量的，如果获得的exo很少，你用200ul重悬，那或许浓度就太低了。。。

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-18 20:48

惜名 发表于 2015-12-18 08:44
这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板，一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是，也要根据你获得exo的 ...

哦，嘻嘻，版主，问题又来了，操作过程是否需要避光呢？请版主大人原谅小的无知，问题多多哈

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-18 23:52

惜名 发表于 2015-12-18 08:44
这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板，一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是，也要根据你获得exo的 ...

惜名版主，根据您的指导，我写了个大概的染色步骤，请您再帮忙指导下看我的理解是否正确：
1、SBI提取外泌体，PBS重选EXO
2、PBS-EXO+1mlDiluent C混匀
3、4ul PKH67 + 1ml Diluent C混匀
4、将步骤3的试剂加入步骤2的液体中，4min
5、2ml BSA 终止染色
6、SBI试剂重提EXO
（注：试剂可按比例适当减量）
问题：整个操作过程是否需要避光？

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作者: 惜名    时间: 2015-12-19 09:28

wanghx_85 发表于 2015-12-18 23:52
惜名版主，根据您的指导，我写了个大概的染色步骤，请您再帮忙指导下看我的理解是否正确：
1、SBI提取外 ...

对的，是这样的步骤。
根据SBI官方的说明，如果你能把最终的体积控制在0.5ml，然后加入0.1ml的ExoQuick，只需要冰上静置0.5小时，然后12000rpm*4min离心，就可以获得exosome了。
在实际操作中，我会尽量把最终的总量控制在0.6ml，然后加入1/5体积的ExoQuick，4度静置40-60min，然后12000rpm*4min离心。

嗯，理论上最好避光，因为PKH67是荧光染料。但是操作过程其实非常短。只需要十几分钟，所以我都没避光。4度静置的时候是避光的。

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-19 22:31

惜名 发表于 2015-12-19 09:28
对的，是这样的步骤。
根据SBI官方的说明，如果你能把最终的体积控制在0.5ml，然后加入0.1ml的ExoQuick， ...

最终总量控制在0.5ML？有难度呀，版主，你看PBS重悬的EXO有100ul，按您说的降低试剂比例来的话，稀释液C 0.3ml至PBS-EXO中，然后配2X染色液：PKH-67中再加0.3ML，两者一混合就有0.7ML了，再加上终止反应的BSA 0.7ML，那就有1.4ML了呀？谢谢版主不厌其烦为我解答。

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作者: 惜名    时间: 2015-12-20 09:40

wanghx_85 发表于 2015-12-19 22:31
最终总量控制在0.5ML？有难度呀，版主，你看PBS重悬的EXO有100ul，按您说的降低试剂比例来的话，稀释液C  ...

我都是直接把0.4ul PKH67加入“PBS-EXO-稀释液”的~

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作者: wanghx_85    时间: 2015-12-21 20:47

惜名 发表于 2015-12-20 09:40
我都是直接把0.4ul PKH67加入“PBS-EXO-稀释液”的~

好的，版主，准备明天试试了，早就该做了，却因为各种原因拖了这么久，谢谢惜名版主连日来的悉心指导，等我实验一次，再来向版主请教。跪谢1

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作者: wanghx_85    时间: 2016-1-14 12:07

惜名 发表于 2015-12-20 09:40
我都是直接把0.4ul PKH67加入“PBS-EXO-稀释液”的~

惜名版主，做了几次失败了，哎，现在都好烦躁，觉得这个外泌体太难做了，为啥我连外泌体都染不上呢？我染了血清外泌体没荧光，染了细胞培养上清外泌体没荧光，是因为我没在25度环境下么？版主，怎样保证25度呢？PKH67放少了？我也是按照你的0.4ul做的呢？提的外泌体有问题？用的SBI试剂提的，鉴定过的啊？血清放的时间久了？-80度两个月，应该没问题吧？细胞培养上清是先提先做的啊，版主大人能够用您丰富的经验为小的解答一下

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作者: 惜名    时间: 2016-1-15 08:48

wanghx_85 发表于 2016-1-14 12:07
惜名版主，做了几次失败了，哎，现在都好烦躁，觉得这个外泌体太难做了，为啥我连外泌体都染不上呢？我染 ...

失败了是啥意思？具体讲讲在哪一步出了问题？
我前天又染了一次，很成功啊，步骤不复杂，也不需要完全25度，室温就可以了。

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作者: wanghx_85    时间: 2016-1-21 11:59
我也不知道哪里出问题了，提了外泌体之后我就用100ulPBS重悬，然后开始PKH67染色，方法是：100ul Diluent C加入PBS-EXO中，然后0.4ul PKH 67 加入100ulDiluent C中，然后将两者混合4分钟，最后200ul0.5%BSA终止反应，最后再重提Exo，加入24孔板中，加完之后我就用荧光显微镜看了下，什么都看不到啊。我在问一下，版主，最后染了色的外泌体和靶细胞共培养一段时间后，是直接4%多聚甲醛固定，然后染核就可以了噻？没啥特殊的步骤吧

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作者: wanghx_85    时间: 2016-1-21 12:10

惜名 发表于 2016-1-15 08:48
失败了是啥意思？具体讲讲在哪一步出了问题？
我前天又染了一次，很成功啊，步骤不复杂，也不需要完全25 ...

再补充下，外泌体提取试剂盒是SBI的，PKH67是Sigma的，BSA比较屌丝，是碧云天花10块钱买的，请版主帮我分析下问题在哪儿？唉，我这个科研屌丝在这条路上越走越远，越陷越深，真不知道什么时候是个头啊

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作者: wjy    时间: 2016-1-21 15:01

wanghx_85 发表于 2016-1-21 11:59
我也不知道哪里出问题了，提了外泌体之后我就用100ulPBS重悬，然后开始PKH67染色，方法是：100ul Diluent C ...

我也做过这个实验，也是sigma的pkh26(红色膜染料)。我是先取1ulpkh26膜染料与100ulexo先孵育增加结合效率，然后加入1ml的 Diluent C，加入200ul1%BSA/PBS（我理解的加入200ul1%BSA/PBS的目的不是的终止反应，是增加连接效率，封闭非特异性的）。然后再体系中加入3ul的PKH26染料室温孵育20min,1h20min,10,0000g超速离心。获得的沉淀用100ul重悬。标记好的exo与细胞共孵育后再共聚焦显微镜下可以看到exo uptake cell

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作者: 惜名    时间: 2016-1-21 16:35

wanghx_85 发表于 2016-1-21 12:10
再补充下，外泌体提取试剂盒是SBI的，PKH67是Sigma的，BSA比较屌丝，是碧云天花10块钱买的，请版主帮我分 ...

你染后用SBI重提离心结束能看到黄色沉淀么？如果能，那说明染色没问题的，如果不能，那就悲剧了。
如果染色没问题，摄取实验看不到绿光，还有可能是细胞没摄取啊。。。

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作者: wanghx_85    时间: 2016-1-22 21:46

惜名 发表于 2016-1-21 16:35
你染后用SBI重提离心结束能看到黄色沉淀么？如果能，那说明染色没问题的，如果不能，那就悲剧了。
如果染 ...

沉淀是什么颜色的我还没注意呢，下周再做再看，版主，您用的是什么孔板做摄取实验（12孔还是6孔？）？每个孔种多少细胞？加入染色的EXO后又共培养多久（24h or 48h）？

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作者: wanghx_85    时间: 2016-1-22 21:48

wjy 发表于 2016-1-21 15:01
我也做过这个实验，也是sigma的pkh26(红色膜染料)。我是先取1ulpkh26膜染料与100ulexo先孵育增加结合效率 ...

我提取EXO的方法不是超速离心，是SBI试剂盒呢，我以后也按照您的方法做一次，难道是分细胞系，孵育的时间短了？

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作者: 惜名    时间: 2016-1-24 12:49

wanghx_85 发表于 2016-1-22 21:46
沉淀是什么颜色的我还没注意呢，下周再做再看，版主，您用的是什么孔板做摄取实验（12孔还是6孔？）？每 ...

我6孔12孔都做过。每孔细胞正常就行啦，或者稍微稀一点。加入exo后培养24小时就应该能看到很明显的摄取了~

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作者: 非文89    时间: 2016-2-23 20:19
宋大师，能否发我一份1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent C的具体染色步骤，61509340@qq.com！大师一生平安！

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作者: 宋梦阳    时间: 2016-2-26 11:39

wooway 发表于 2015-9-16 14:23
我想请教下如果我这里没有超速离心机，可否染色后再用EXOquick提取外泌体呢？大家是否有做过 ...

可以的，用试剂盒提取比较快，可能外泌体的直径比较小

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作者: 宋梦阳    时间: 2016-2-26 11:42

非文89 发表于 2016-2-23 20:19
宋大师，能否发我一份1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent C的具体染色步骤，！大师 ...

好久没登陆了，已发送，请查收

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作者: 宋梦阳    时间: 2016-2-26 11:45

wanghx_85 发表于 2015-10-17 23:11
求具体操作步骤，邮箱：，非常感谢！

太久没有登录，不好意思，已发

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作者: op1116    时间: 2016-2-26 21:21

宋梦阳 发表于 2016-2-26 11:45
太久没有登录，不好意思，已发

大师，同求具体实验步骤一份~896019708@qq.com

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作者: wanghx_85    时间: 2016-3-3 11:02

宋梦阳 发表于 2016-2-26 11:45
太久没有登录，不好意思，已发

已收到，非常感谢！

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作者: cherry    时间: 2016-3-15 22:26

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

求PKH67 染色操作步骤~

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作者: cherry    时间: 2016-3-15 22:27

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

忘了留邮箱 327035765@qq.com ,求PKH67染色操作步骤

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作者: Dean_91    时间: 2016-3-21 17:19
宋大师，同求PKH67染色步骤，谢谢！

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作者: Dean_91    时间: 2016-3-21 17:19
宋大师，同求PKH67染色步骤，谢谢！邮箱是guowei365@126.com

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作者: denisqiang    时间: 2016-4-7 13:07
求PKH67染色步骤，邮箱denisqiang@126.com
另外请教EXO重悬浓度控制在多少？谢谢

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作者: smilence2012    时间: 2016-4-7 16:04
sigma的产品说明书非常详细

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作者: c1c2c3c45678    时间: 2016-4-27 16:16

宋梦阳 发表于 2015-10-16 15:37
EXO染色步骤，已发

求EXO染色步骤

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作者: c1c2c3c45678    时间: 2016-4-27 16:21

hereissyk 发表于 2015-10-18 10:23
同求一份，好人一生平安

求宋梦阳的那个EXO染色步骤,邮箱 chenxiaochao1004@163.com

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作者: ron1987    时间: 2016-4-28 22:21
我也放个邮箱吧。。ronyan2014@163.com
不过话说直接发个帖把步骤帖出来就好啦~~

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作者: wangkaixin    时间: 2016-5-19 01:04

宋梦阳 发表于 2015-10-16 15:37
EXO染色步骤，已发

你好，能不能发我一份染色步骤，新手刚开始做外泌体，好多琢磨不明白。谢谢你拉1527109313@qq.com

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作者: wangkaixin    时间: 2016-5-19 01:30

惜名 发表于 2015-8-28 17:46
大师不敢当
PKH还是4ul。exo只定量过一次，刚开始做鉴定时定量的，后来做功能都没定量（太费）。 ...

想问一下BCA定量怎么去测外泌体，做一次记BCA需要多少量的外泌体？我看BCA说明书里，加96孔板做都需要1ml左右的外泌体量，但是我提的外泌体只溶解在了100ul的PBS里，所以一直很纳闷，想做BCA，但不知道怎么去做。求具体步骤 我邮箱1527109313@qq.com 非常感谢

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作者: wangkaixin    时间: 2016-5-19 01:34

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

这个贴子实在是太赞了，有好多不懂的地方希望指点。Diluent Ca是什么溶液？ 还有想要英文文献，继续留邮箱1527109313@qq.com 谢谢谢谢

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作者: wangkaixin    时间: 2016-5-19 01:41

惜名 发表于 2015-12-18 08:44
这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板，一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是，也要根据你获得exo的 ...

问题又来了，几个细胞共培养的时候怎么保证加入的外泌体量都一致呢？是不是加之前，外泌体都需要做一个BCA定量啊。

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作者: wangkaixin    时间: 2016-5-19 01:58

宋梦阳 发表于 2016-2-26 11:42
好久没登陆了，已发送，请查收

能否发我一份PKH67染色步骤，非常感谢 1527109313@qq.com

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作者: zyjjxb    时间: 2016-6-4 08:45

宋梦阳 发表于 2015-10-16 15:37
EXO染色步骤，已发

能发给我一份吗 569232516@qq.com

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作者: qyhhzyh    时间: 2016-6-12 10:21

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

您好，请问能否发我一份用PKH26染外泌体的的protocol，我试着按别人的方法染过，发现洗涤外泌体时，100000g离心的话，多余的染料也会沉降下来，根本无法去除，不知道您是怎么去除多余的染料的。

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作者: qyhhzyh    时间: 2016-6-12 10:24

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:17
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效 ...

您好，请问能否发我一份用PKH26染外泌体的的protocol，我试着按别人的方法染过，发现洗涤外泌体时，100000g离心的话，多余的染料也会沉降下来，根本无法去除，不知道您是怎么去除多余的染料的。641505532@qq.com

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作者: cherry    时间: 2016-6-12 10:53

qyhhzyh 发表于 2016-6-12 10:21
您好，请问能否发我一份用PKH26染外泌体的的protocol，我试着按别人的方法染过，发现洗涤外泌体时，10000 ...

我的也是，我是用PKH67 染色，多余的染料也会超离沉降下来

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作者: qyhhzyh    时间: 2016-6-12 10:57

cherry 发表于 2016-6-12 10:53
我的也是，我是用PKH67 染色，多余的染料也会超离沉降下来

而且我用空白的PBS做对照，也加入了染料，结果去侵染细胞时，细胞也被染上了色。另外请问一下，你加入标记的外泌体多长时间去观察的？

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作者: cherry    时间: 2016-6-12 13:25

qyhhzyh 发表于 2016-6-12 10:57
而且我用空白的PBS做对照，也加入了染料，结果去侵染细胞时，细胞也被染上了色。另外请问一下，你加入标 ...

你用BSA 终止染色反应没有？ 我是加入exosome 24h 观察的

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作者: qyhhzyh    时间: 2016-6-12 13:31

cherry 发表于 2016-6-12 13:25
你用BSA 终止染色反应没有？ 我是加入exosome 24h 观察的

嗯，加入BSA终止反应了。终止反应后PKH26是不是就不应该再起作用了？

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作者: QWiuei    时间: 2016-6-18 15:46

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

能否发我一份PKH67染色步骤，非常感谢 qwiuei@163.com

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作者: 墨染荼蘼    时间: 2016-7-6 16:45

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

大师，同求具体实验步骤一份shincy_j@163.com

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作者: muzi.csu    时间: 2016-7-6 20:05
大神，同求具体实验步骤一份651035047@qq.com  O(∩_∩)O谢谢

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作者: wangxw    时间: 2016-7-8 15:03
能否发我一份PKH67染色步骤，非常感谢913054042@qq.com

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作者: 王一刀    时间: 2016-7-20 11:15

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

宋老师，麻烦您给我发一份PKH67染色步骤和相关文献吧，非常感谢，好人一生平安

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作者: 王一刀    时间: 2016-7-20 23:11

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

宋老师，麻烦您给我发一份PKH67染色步骤和相关文献吧，非常感谢，好人一生平安，wjw20092796@163.com

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作者: zouxue1985    时间: 2016-7-21 09:16
宋老师，麻烦您给我发一份PKH67染色步骤和相关文献吧，非常感谢，好人一生平安，zouxue1985@126.com

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作者: yuantingdong    时间: 2016-7-21 20:57

宋梦阳 发表于 2015-10-16 15:38
已发，注意查收。

您好！可否麻烦您发一份PKH67染色的步骤给我，十分感谢！邮箱tingdongy1991@163.com

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作者: 栩栩    时间: 2016-8-1 10:57

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

求文献啊！！多谢多谢！148314967@qq.com

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作者: wangxw    时间: 2016-8-8 11:54
大神，同求exosomes染色步骤一份 913054042@qq.com

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作者: 卉凝2016    时间: 2016-9-16 12:48
大神，同求exosomes染色步骤一份1985158112@qq.com，拜谢！

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作者: yuantingdong    时间: 2016-10-17 14:41

惜名 发表于 2015-12-19 09:28
对的，是这样的步骤。
根据SBI官方的说明，如果你能把最终的体积控制在0.5ml，然后加入0.1ml的ExoQuick， ...

惜名兄，我查看SBI说明书，步骤跟你说的不一样，为何你的是4度静置40-60min,然后12000*4min离心。谢谢。
SBI试剂盒提取外泌体具体步骤：
1、细胞培养液离心，3000g *15min，取上清。
2、培养液上清与提取试剂(ExoQuick-TC)5:1，颠倒3次，静置12小时。
3、离心1500g *30min，吸除上清。
4、离心1500g*5min，进一步去除残余上清。
5、鉴定：50ulPBS重悬，-80℃保存。
   提蛋白：加蛋白裂解液
   提RNA：加trizol

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作者: 惜名    时间: 2016-10-18 17:23

yuantingdong 发表于 2016-10-17 14:41
惜名兄，我查看SBI说明书，步骤跟你说的不一样，为何你的是4度静置40-60min,然后12000*4min离心。谢谢。
...

静置40-60min是因为我浓缩以后，体积很小了，只要半个多小时就可以。如果你是10ml的体积，还是要过夜的

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作者: 小七果果8    时间: 2016-10-22 15:55

惜名 发表于 2015-9-16 14:44
可以。
我就是这么干的。

求荧光标记后，不用超速离心，再次用EXOquick的具体步骤~谢啦!!☆⌒(*＾-゜)v

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作者: 小七果果8    时间: 2016-10-22 16:09

惜名 发表于 2015-9-16 14:44
可以。
我就是这么干的。

请问惜名前辈，荧光标记，BSA终止标记后需要加多少PBS，然后再用EXOquick啊？老害怕提两次，会有很多杂质，而且多余的荧光会不会干扰BCA蛋白测定结果呢？

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作者: 惜名    时间: 2016-10-22 20:38

小七果果8 发表于 2016-10-22 16:09
请问惜名前辈，荧光标记，BSA终止标记后需要加多少PBS，然后再用EXOquick啊？老害怕提两次，会有很多杂质 ...

不用加PBS了啊。。。我直接加exoquick然后静置、离心的。。。但是，有时看不到沉淀，感觉不是很稳定~
多余的荧光染料估计很难避免，所以如果能用超离是最好的。试剂盒总是存在各种污染的问题

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作者: 小七果果8    时间: 2016-10-22 21:23

惜名 发表于 2016-10-22 20:38
不用加PBS了啊。。。我直接加exoquick然后静置、离心的。。。但是，有时看不到沉淀，感觉不是很稳定~
多 ...

之前用BSA终止标记，14000g离心2h后并没有发现什么沉淀，测BCA含量很低，这次没有用超速离心，是标记后又加了次exoquick，1500g 30min，测BCA浓度3000微克/ml，感觉这次提出来浓度太高，害怕是杂质……对了前辈，用100000g超离会不会损伤外泌体活性，因为我打算做的是动物实验，求指导~

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作者: xixihaha    时间: 2016-10-29 22:12
宋老师，给我发一份PKH染色的步骤，谢谢！815018560@qq.com

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作者: dancing    时间: 2016-10-31 14:46

惜名 发表于 2015-8-22 10:15
是时候亮出这篇文献了：Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate ...

请问外泌体染色之后直接跟细胞一起培养吗，细胞要怎么染色？

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作者: destiny    时间: 2016-11-7 15:53

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

宋老师，麻烦您给我发一份PKH67染色步骤和相关文献吧，非常感谢，好人一生平安，59418976@qq.com。

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作者: 玉帝小儿    时间: 2016-12-1 10:38

宋梦阳 发表于 2015-10-13 11:19
我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果 ...

求pkh67染色具体方法，谢谢。553926837@qq.com

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作者: Marvel    时间: 2016-12-4 14:27
大神，同求exosomes染色步骤一份  753262246@qq.com  跪谢、、。

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