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标题: qEV 部分数据 [打印本页]
作者: hzangs    时间: 2015-9-16 13:57
标题: qEV 部分数据
本帖最后由 hzangs 于 2015-9-16 14:06 编辑

蛋白浓度和WB的结果。粒子浓度测定那边出了点问题，帮我们测浓度朋友意外受伤，需要周末才能给我数据，带数据到了，我会写一份详实的报告。大家就等了。
[attach]219[/attach]

[attach]218[/attach]




我的protocol 附于此，供目前有试用装的同学尝试。
需要准备的材料有：0.2um滤器过滤过的PBS 50ml、15ml离心管、5ml离心管、1.5ml离心管，15ml超滤管、2ml超滤管等。
protocol：
1、培液2000g 离心10min 取上清到新离心管，
2、10000g 离心30min 取上清到新离心管，
3、超滤管（cat#UFC910008 merck miloppor）5000rpm，10min 浓缩50倍，
4、参考qEV说明书，使用PBS作为洗脱液进行exosomes的分离。
5、第3-第4ml的1ml洗脱液，使用2ml超滤管浓缩至200ul。即exosomes 的PBS溶液。

qEV操作方法：需要准备的材料有 timer、0.2um滤器过滤过的PBS 50ml、15ml离心管、5ml离心管、1.5ml离心管、NaN3低浓度溶液（有毒性，小心操作）。
1、垂直夹住qEV柱子，小心打开上盖，避免内外气压变化过大而毁坏柱子。
2、15ml离心管置于qEV柱下方作为大收集管，打开qEV柱子下盖。（柱子的上盖和下盖不要扔，需要用的）timer开始记录时间，并观察液滴开始滴到收集管内。注意从柱子上方补充PBS，柱子上方PBS存量不要超过2ml。记录收集管内收集5ml洗脱液的时间。
3、当收集管内有10mlPBS时，可认为柱平衡结束，取柱子下盖，内冲PBS赶走气泡。待柱子上方PBS液面接近柱材上缘时使用柱子下盖封闭柱子下方出口，将500ul浓缩的培液样本轻轻上样到柱子内。
4、下方收集管换成5ml离心管，去除柱子下盖，开始洗脱。待样品液面上缘即将进入柱子时加入PBS继续洗脱（千万不要让柱材干掉。进入气泡后柱子就废了）。
5、时刻注意补充洗脱液，当下方收集管内液体到达3ml时，迅速换1.5ml离心管作为收集管，收集1ml洗脱液（该1ml洗脱液即为exosomes 的PBS溶液），在用1.5ml管收集0.5ml备用（这0.5ml里面还有一点点exosomes，但会有一些杂蛋白）。
6、换15ml管作为收集管，收集废液，使用约3-4ml PBS清洗qEV柱（一般可以将培液的红色全部洗去）。之后用8ml含有NaN3的PBS（或一定浓度的酒精溶液）清洗回收qEV柱（NaN3主要用于防菌），再加入2mlPBS保持柱材上方存有液体，先盖上盖再该下盖，将qEV柱竖直存放在4°待下次使用。



欢迎大家交流讨论提意见。

作者: 惜名    时间: 2015-9-16 14:46
先占坑！
再看文！
作者: xuxu    时间: 2015-9-16 14:54
不知道楼主是用的什么细胞，我之前跑过细胞的Alix，有很深的条带，你这边一点都没有啊...
作者: hzangs    时间: 2015-9-16 14:57
xuxu 发表于 2015-9-16 14:54
不知道楼主是用的什么细胞，我之前跑过细胞的Alix，有很深的条带，你这边一点都没有啊... ...

这个是A549 肺癌细胞系。 因为上样量比较低。每个孔 我只上了1.5ug蛋白哦
作者: xuxu    时间: 2015-9-16 15:22
hzangs 发表于 2015-9-16 14:57
这个是A549 肺癌细胞系。 因为上样量比较低。每个孔 我只上了1.5ug蛋白哦

哦~
再次请教大神，你跑Alix用超离的方法，上样用了多少ug出来的那么深的条带啊？你的超离那组图片里有一条很深有一条基本看不见的，是不是因为上样量不一样啊？
作者: hzangs    时间: 2015-9-16 15:25
本帖最后由 hzangs 于 2015-9-16 15:29 编辑
xuxu 发表于 2015-9-16 15:22
哦~
再次请教大神，你跑Alix用超离的方法，上样用了多少ug出来的那么深的条带啊？你的超离那组图片里有一 ...

这张western图 每个孔都是上样1.5ug。压片15min的结果。 那两个超离之所以不一样结果，是因为后面一个泳道的样品是曾经反复冻融并且在-30存放了半年的，估计是样品已经坏掉了。
作者: xuxu    时间: 2015-9-16 16:34
hzangs 发表于 2015-9-16 15:25
这张western图 每个孔都是上样1.5ug。压片15min的结果。 那两个超离之所以不一样结果，是因为后面一个泳道 ...

好哒，明白了，非常感谢！
作者: 春天的猪    时间: 2015-9-28 21:31
你好，想请问一下图上的红色线条是什么意思？
作者: hzangs    时间: 2015-9-28 22:33
春天的猪 发表于 2015-9-28 21:31
你好，想请问一下图上的红色线条是什么意思？

避免图被复制做他用  而加上去的防盗线



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