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标题: Nature子刊：sEV分泌抑制剂的效果不能重复，原作者回应 [打印本页]
作者: Johnny    时间: 2021-2-28 17:28
标题: Nature子刊：sEV分泌抑制剂的效果不能重复，原作者回应
本帖最后由 Johnny 于 2021-2-28 17:28 编辑

Nature子刊：新报道的sEV分泌抑制剂的效果不能重复，原作者回应


2019年，Baek研究团队在Nature Communications杂志发表文章（https://www.exosomemed.com/5711.html），报道了抗菌药物通过抑制肿瘤外泌体分泌发挥抗癌作用。该研究通过筛选FDA批准的药物库，确定了口服抗菌药物磺胺异恶唑（SFX）作为乳腺癌细胞生物发生和分泌sEV的特异性抑制剂，从而有效抑制乳腺癌生长和转移无明显毒性。

近日，澳大利亚拉筹伯大学的Suresh Mathivanan团队在体内研究中寻找可阻止EV生物发生和分泌的化合物时，打算使用SFX，因此将体外表征作为第一步。然而，Mathivanan团队发现，用SFX处理两种癌细胞并不能减少EV的数量。

   

该研究发现，用SFX处理4T1乳腺癌细胞并没有减少EV的数量。作者也承认，他们的EV分离方法与原始报道的方法不同（图1），因此可能导致不同的结果。为了排除EV分离或细胞类型依赖性方法差异的可能性，三名研究人员严格遵循原作者采用的方法（图1 的protocol 1和2）从两种不同细胞类型（4T1、MDA-MB231）中分离EV。Protocol 1（图1b）与Im等报道的Protocol完全相同，而Protocol 2是作者在尝试重复他们的实验时与他们联系时提供的。对于Protocol 2（图1），通过对Protocol1的细微修改，分离出EV（在2500×g的条件下进行15分钟的离心分离，并在4℃将sEV孵育1h）。与Protocol 1相比，Protocol2中的修改在图1b中用*表示。


两组细胞培养、药物处理和sEV分离的示意图

所有这些测定均针对每个生物重复进行三个技术重复（将相同批次的细胞接种在三个不同的培养皿中）进行。与之前的观察一致，用不同浓度的SFX（50、100和200μM）处理癌细胞不会阻碍EV的释放，而低浓度（5μM）的阳性对照神经酰胺抑制剂GW4869则抑制了EV的分泌。EV分离后，对蛋白质含量、颗粒数量进行了定量，并对富含EV的蛋白质（TSG101、Alix）进行了蛋白质印迹分析，所有这些都标准化为相等的细胞数（图2和补充图1）。与原作者声称的SFX处理结果（导致EV颗粒数量下降了3倍）相反，该研究观察到SFX（200μm）处理后颗粒数量显著增加。


有或没有SFX和GW4869处理的细胞释放的EV的定量

即使该研究作者遵循原作者报告的确切方案，该研究作者也承认研究之间存在一些不同的变量。例如，两项研究中使用的细胞系可能来自不同的传代，并且在连续培养后可能遗传分化。同样，两项研究中使用的FBS、条件培养基、NTA设备和软件也有所不同。两项研究之间的另一个差异是，MDA-MB231细胞分泌的EV蛋白量相差10倍（Baek组报告每百万细胞7µg，Mathivanan组报告每百万细胞0.7µg）。但是，对于药物孵育研究，无论这些变量如何，都应观察到抑制或增加EV释放的总体趋势。例如，据报道，神经酰胺抑制剂GW4869降低了几组EV的释放，而与分离方案和细胞培养变量无关。

总体而言，该研究报告SFX并不能减少EV的释放（三名独立研究人员），并强调在使用SFX作为阻止EV释放的药物时要谨慎。然而，尽管该结果表明观察到的表型可能不是癌细胞衍生的EV介导的，但该研究作者承认该发现并未挑战SFX介导的减轻原发性肿瘤负担和转移的主要结论。 SFX如何减少原发性肿瘤负担并抑制转移，尚需进一步研究。

对此，原作者Baek团队进行了回应。



原作者最初的报道显示了SFX抑制了MDA-MB231人乳腺细胞系中sEV的分泌。此外，两名独立研究人员再次通过盲法测试确认了原始结果。原作者确信，SFX在他们的实验中确实抑制了小的细胞外小泡（sEV）的分泌。

用来分离sEV的方法与已出版的手稿相同；将从MDA-MB231细胞获得的上清液以300×g / 3 min，2500×g / 20 min和10,000×g / 30 min连续离心。此外，将细胞用含10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）/高葡萄糖（HyClone，SH30243.01）接种，但将其在DMEM /高葡萄糖中孵育，用SFX处理细胞时，不使用FBS。

原作者认为，应从本质上考虑这两点。首先是SFX的细胞毒性作用，这可能是由于不同公司的SFX意外杂质造成的。原作者在所有实验中均使用了没有细胞毒性的SFX浓度。 如果药物引起细胞毒性，分泌的sEV数量可能会增加。其次，在原作者的实验室研究中，EV去除的FBS中仍然残留大量颗粒。因此，可能难以观察到使用缺乏EV的FBS对sEV分泌的抑制作用。


有或没有SFX 100 µM处理的MDA-MB-231细胞的sEV分泌
所有实验均采用盲法测试

参考文献：ImEJ, Lee CH, Moon PG, Rangaswamy GG, Lee B, Lee JM, Lee JC, Jee JG, Bae JS, KwonTK, Kang KW, Jeong MS, Lee JE, Jung HS, Ro HJ, Jun S, Kang W, Seo SY, Cho YE,Song BJ, Baek MC. Sulfisoxazole inhibits the secretion of smallextracellular vesicles by targeting the endothelin receptor A. NatCommun. 2019 Mar 27;10(1):1387. doi: 10.1038/s41467-019-09387-4.PMID: 30918259; PMCID: PMC6437193.
FonsekaP, Chitti SV, Sanwlani R, Mathivanan S. Sulfisoxazole does not inhibit thesecretion of small extracellular vesicles. Nat Commun.2021 Feb 12;12(1):977. doi: 10.1038/s41467-021-21074-x. PMID: 33579909.
LeeCH, Bae JH, Kim JI, Park JM, Choi EJ, Baek MC. Reply to 'Sulfisoxazole doesnot inhibit the secretion of small extracellular vesicles'. NatCommun. 2021 Feb 12;12(1):976. doi: 10.1038/s41467-021-21075-w.PMID: 33579906.附件已隐藏，回复该贴可查看附件  附件已隐藏，回复该贴可查看附件  



作者: zacharywang123    时间: 2022-5-16 20:32
多谢分享，thanks



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