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标题: JEV：工程化的细胞外囊泡作为CRISPR基因组编辑递送载体 [打印本页]
作者: Johnny    时间: 2021-4-2 20:20
标题: JEV：工程化的细胞外囊泡作为CRISPR基因组编辑递送载体
JEV：工程化的细胞外囊泡作为CRISPR基因组编辑递送载体

基于CRISPR的基因组编辑效应子的瞬时递送对于减少脱靶效应和免疫反应非常重要。最近，已有研究报道了Cas9核糖核蛋白（RNP）递送的细胞外囊泡（EVs）。但是，缺乏将RNP富集到EV中的机制限制了EV作为RNP递送工具的效率。近日，维克森林大学卢柏松教授团队在J ExtracellVesicles杂志上发表文章，描述了一种将RNP主动富集到EV中的机制。从而提高使用EVs作为递送载体的基因编辑效率。



基于生成机制，细胞外囊泡（EVs）可以大致分为两大类，外泌体和微囊泡。外泌体是通过多囊泡体的向内出芽以及随后多囊泡体膜与质膜融合而由各种细胞释放的异质膜囊泡。外泌体在细胞间交流和疾病发病机理中起重要作用，并且通过将RNA、蛋白质和脂质从一种细胞转运到另一种细胞而发挥功能的。微囊泡是由质膜向外发芽和裂变，然后将囊泡释放到细胞外空间中而产生的。外泌体和微囊泡大小重叠，目前很难在制备中分离两种类型的囊泡。

EVs的运输能力促使人们探索将EVs用作药物递送的囊泡。近年来，EVs已被探索为传递Cas9 RNP或dCas9RNP的载体，用于基因编辑和基因调控目的。所有这些研究都没有将RNPs主动富集到EV中的机制，只是在一项研究中，使用抗原/抗体相互作用将RNPs富集到外泌体中，并且报道了相对较低的基因编辑活性。需要有效地将RNP富集到EV中的机制，以使用EV作为传递载体来提高基因编辑效率。

此前，该团队使用了适体和适体结合蛋白（ABP）之间的特异性相互作用，将Cas9或腺嘌呤碱基编辑器RNP包装到慢病毒衣壳中，以将RNP有效地递送到人细胞中。将短的RNA aptamer com插入到sgRNA支架中，并将ABP Com与慢病毒Gag蛋白的核衣壳蛋白融合。com和Com之间的特异性相互作用将sgRNA募集到慢病毒衣壳中，而sgRNA和Cas9蛋白之间的固有亲和力介导了整个RNP复合物进入慢病毒衣壳的包装。这些衣壳在基因编辑中非常高效，并且在多个靶标上产生的INDEL率> 80％。

四跨膜蛋白CD63富含于外泌体，通常用作外泌体的分子标记。它已被用作ABP的融合伴侣，可将含适体的mRNA富集到EVs中。然而，由于受体细胞中的快速降解，EV递送的mRNA不起作用。水泡性口腔炎病毒G蛋白（VSV-G）通过帮助病毒颗粒通过低pH诱导的膜融合从内体中逸出，对水泡性口腔炎病毒（VSV）感染至关重要。这种融合活性使VSV-G成为慢病毒载体广泛使用的假型包膜蛋白，并且是用于膜和蛋白质递送的融合蛋白。

将Cas9 RNP募集到EV中并帮助RNP在递送后从内体系统逃逸的机制将大大提高EV介导的RNP递送的效率。该研究描述了一种主动将Cas9或ABE RNP募集到EVs中的方法。将CD63与ABP Com融合在一起，并使用com / Com交互作用将Cas9 RNP主动富集到EVs中。进一步使用VSV-G蛋白来帮助Cas9RNP从受体细胞中的内体系统逃逸。数据表明，作为用于基因组编辑的RNP传递工具，工程EVs显示出更高的效率和安全性。


将RNP富集到EVs的策略

使用RNA适体和适体结合蛋白（ABP）之间的特异性相互作用，将RNP富集到EV中。将RNA适体com插入到单个向导RNA（sgRNA）中，并将com结合ABP Com融合到在外泌体中丰富的四跨膜蛋白CD63的两个末端。研究发现，Com / com相互作用通过形成包括CD63-Com融合蛋白、com-修饰的sgRNA和Cas9或ABE的三组分复合物，使Cas9和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）RNP富集到EV中。富含RNP的EV在基因组编辑和瞬时表达方面非常有效。该系统能够递送靶向多个基因座的RNP以进行多重基因组编辑。另外，来自不同物种的Cas9可以一起使用。EV递送的RNP在体内具有活性。数据显示，适体和ABP相互作用可用于将RNP主动富集到EV中，以提高基因组编辑效率和安全性。


EV体内递送Cas9RNP
A. EV递送RNP治疗后，TA肌肉中INDEL的NGS分析。在48小时内，向del52hDMD/mdx小鼠胫前（TA）肌肉注射了4000万个细胞产生的EV。列出了在一只治疗过的腿中观察到的序列。带下划线的是sgRNA的靶序列，并突出显示了PAM区。预测的切割位点由垂直虚线指示。B. 在对照和DMD Cas9 RNP注射的TA肌肉中肌营养不良蛋白的免疫染色。在48小时内，向TA肌肉注射了200万个细胞产生的EVs。

参考文献：YaoX, Lyu P, Yoo K, Yadav MK, Singh R, Atala A, Lu B. Engineered extracellularvesicles as versatile ribonucleoprotein delivery vehicles for efficient and safe CRISPR genome editing. J Extracell Vesicles. 2021Mar;10(5):e12076. Epub 2021 Mar 16. PMID: 33747370.
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作者: dongfeng    时间: 2022-3-9 16:52
谢谢分享
作者: jhh81818    时间: 2022-8-11 16:15
谢谢分享，收获满满



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