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标题: 大家关于试剂盒的几点疑问和澄清 [打印本页]

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作者: seallin    时间: 2015-10-26 13:59
标题: 大家关于试剂盒的几点疑问和澄清


群里有很多人对试剂盒（SBI,Life etc）存在一点疑问，我做了快1年多的实验了，觉得还是应该站出来说几句。

首先陈述两个实验
1、通过试剂盒对照实验发现，空白血清（exo-free）并不能提取到沉淀，而培养过细胞的血清则能提取到沉淀，说明提取到的不是蛋白聚集体，不然空白血清中那么高的蛋白含量也应该有沉淀才对。
2、血清经过10000g离心，又经过0.22 um滤膜过滤，用试剂盒提取后，能提取到沉淀（由上文证明不是蛋白聚集体），因此沉淀应该不可能是细胞碎片，故应该就是exo

写到这里，我想大家应该也认为试剂盒提取到应该是exo

但是大家为什么会对试剂盒有疑问呢？无非是三个问题，1、很难重溶；2、TEM不好做；3、WB不好做；4、沉淀量远远超过超速离心
下面我来解释一下，
1、并非不好重溶，加入水用枪头一吹打，立马就溶了，如果觉得不好重溶的一定是你方法不对；
2、由于有聚合物，TEM确实非常难做（这是试剂盒的一大缺点），我曾经做了3天的HRTEM（200 kv）才做出来；
3、WB不好做不是提取的问题，是提取的不够纯。为什么不够纯，下面重点介绍：高速离心的时候，我们第二遍会用PBS再离一遍以除去血清蛋白，而试剂盒的protocol里没有清洗这一步，这导致提取的exo中含很多血清蛋白。做实验小心一点，尽量去除管壁上的残留，实在不行，重溶后再提一遍，效果会很好；
4、如果用24h超离的血清培养细胞后，再用试剂盒，沉淀量会非常小，因此，我认为可能是血清没有离心干净的原因。

最后补充两句，
1、方法有好坏，技能有高低，如果实验做的熟练了，尽量避免可能出现的问题，还是可以做出很好的结果的。祝大家实验顺利！
2、如果是后续的分析和检测，两种方法都行，当然试剂盒更加方便。如果是用到exo做其他实验，比如尾部注射，还是安心用超离吧

Lobb RJ Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma, J Extra Vesc, 2015的这篇文献是有问题的，因为的对照组，沉淀得到的样品根本就没有洗干净，所以做出来的结果当然不好。用一个不正确的方法进行对比，结果可想而知。

最后很感谢与Hzangs的交流，提出了一些关键的问题，我会就一些问题进行近一步的考察。

如果还有疑问，欢迎留言

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作者: seallin    时间: 2015-10-26 14:43

hzangs 发表于 2015-10-26 14:15
通过试剂盒对照实验发现，空白血清（exo-free）并不能提取到沉淀，而培养过细胞的血清则能提取到沉淀，说明 ...

大家互相交流，才能碰撞思维的火花。
其实kit提取的蛋白里有很多杂蛋白，是因为有血清的残留，不是因为聚合物抓取了杂蛋白，如果用试剂盒再提一次（沉淀重溶后再加kit），能够大大减少杂蛋白的含量。但是再用一次试剂盒，大家的成本就更高了，所以我在上文中没有推荐。另外我们能在实验中发现这个现象，kit提完一次后，下面的pellet是白的，重溶后就变微红了，这是因为管壁上还残留很多杂蛋白及其酚红，我们知道酚红与蛋白疏水部分存在很强的疏水作用力，因此有红色表明有游离的杂蛋白，这才导致了污染。

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作者: hzangs    时间: 2015-10-26 15:07

seallin 发表于 2015-10-26 14:43
大家互相交流，才能碰撞思维的火花。
其实kit提取的蛋白里有很多杂蛋白，是因为有血清的残留，不是因为聚 ...

很高兴能和你交流这些东西。

请问 有尝试过将kit沉淀的东西重新溶解然后再用kit沉淀一遍么， 结果如何， 是不是真的蛋白含量就少了， 现在有这方面的数据吗？  我也曾经尝试过将用kit 沉淀，但是沉淀出来之后并不只是蛋白含量很大，而且底部的pellet也很多，要比超离明显多很多。这也说明，杂蛋白确实是在沉淀里的，不仅仅是在管壁上的。
24h和10h处理血清来说   这个我都没有尝试过，不知道你尝试过没有。 我的血清都是使用12Wg 超离14-16小时（overnight）处理的。 关于2小时是否可以完全沉淀培液中的exosomes， 这个实验我还是验证过的。 11w g 70min超离后的上清再超离 确实不会再有沉淀， 说明沉淀还是相对比较充分的。
文献里要求血清过夜超离的原因主要是因为血清相对于培液来说要粘稠很多，所以可能需要更长的时间才会成分沉淀其外泌体，达到去除的目的。

如果没有记错的话，楼主应该是化物所的吧，还希望楼主能详细的解释一下PEG-base的沉淀试剂盒 沉淀分离exosomes的具体原理~

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作者: seallin    时间: 2015-10-26 15:46

hzangs 发表于 2015-10-26 15:07
很高兴能和你交流这些东西。

请问 有尝试过将kit沉淀的东西重新溶解然后再用kit沉淀一遍么， 结果如何， ...

我也很高兴能与您探讨！
再来一遍的话，如果跑胶对比，可以明显发现60-70kDa的条带变浅了很多，因为血清中TF和BSA是占80%以上的，所以经过两次沉淀，能够尽可能多的除去血清蛋白。但是毕竟外泌体表面是带负电荷的，而且也不亲水，难免有杂蛋白非特异性吸附，BSA，TF等蛋白也无法除尽。关于聚合物沉淀的原理，我不认同文献中竞争结合水的观点。

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作者: hzangs    时间: 2015-10-26 16:41

seallin 发表于 2015-10-26 15:46
我也很高兴能与您探讨！
再来一遍的话，如果跑胶对比，可以明显发现60-70kDa的条带变浅了很多，因为血清 ...

两次沉淀， 收到的沉淀 蛋白定量  和超离定量  会有多大差距？  这个我还真没做过呢~ 因为杂蛋白的问题，并且我确实发现kit沉淀分离的所谓的外泌体  对我的实验有影响并且会带来假阳性结果  所以我才极力反对沉淀法的kit。
你认为PEG-base的沉淀试剂盒的沉淀原理是什么呢？

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作者: hzangs    时间: 2015-10-26 16:50
目前我不建议大家用沉淀试剂盒分离的最主要原因有二：
1、我曾经将life的试剂盒沉淀的所谓的外泌体和超离的外泌体同时做实验，kit沉淀的 出现了假阳性。
2、坛子里的朋友，有人使用kit分离外泌体做实验，然后投paper的时候被reviewer质疑了。
正因为基于上述的两方面问题，
以及直观的观察，kit沉淀的量要远远的多于超速离心法分离出来的沉淀量，而超离分离所得到的又是培液里几乎所有的exosomes了，所以我直观的认为，沉淀法分离的所谓的外泌体中应该有着大量的杂蛋白。

综合上面的这些原因， 所以建议大家不要用沉淀法的kit~~

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作者: seallin    时间: 2015-10-26 16:55

hzangs 发表于 2015-10-26 16:41
两次沉淀， 收到的沉淀 蛋白定量  和超离定量  会有多大差距？  这个我还真没做过呢~ 因为杂蛋白的问题， ...

恩，我理解你的想法，对于后续需要用到exo的实验，还是超离最好，这点我认同。试剂盒缺点确实比较多：1、聚合物粘在exo外，很难除掉；2、若无滤膜过滤步骤，颗粒大小会不均一；3、若方法不正确，会带来较多杂蛋白。

但是试剂盒也有其优势的，如果只是后续exo里蛋白、脂类和RNA的检测和分析，在分析领域还是较好的。不过如果要用提出来的exo做进一步的实验，我的建议也是超离。

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作者: hzangs    时间: 2015-10-26 17:10

seallin 发表于 2015-10-26 16:55
恩，我理解你的想法，对于后续需要用到exo的实验，还是超离最好，这点我认同。试剂盒缺点确实比较多：1、 ...

部分同意你的观点。但是如果后期是用来做蛋白质谱或者脂类的话，我同样是不建议使用kit。 如果后期是用来做大规模的seq，可以考虑，毕竟培液里游离的RNA相对来说比较少。同时，我并不认为沉淀法的kit 有什么优势。当我用life的kit时候，从离心机把管子拿出来，看到那一堆沉淀的一刹那，我就感觉，这个太扯了。。。 沉淀量足足有超离分离的上百倍。。。。。。

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作者: seallin    时间: 2015-10-26 17:17

hzangs 发表于 2015-10-26 17:10
部分同意你的观点。但是如果后期是用来做蛋白质谱或者脂类的话，我同样是不建议使用kit。 如果后期是用来 ...

嗯呢，但是如果24h离心的血清培养细胞后，用kit沉淀会很少~~~~因为那次，我都惊呆了，本以为会很多，结果就底下一点点~~我还以为是我方法有问题，结果重复一次还是这样

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作者: hzangs    时间: 2015-10-26 17:29

seallin 发表于 2015-10-26 17:17
嗯呢，但是如果24h离心的血清培养细胞后，用kit沉淀会很少~~~~因为那次，我都惊呆了，本以为会很多，结果 ...

但是你的这个实验并不能证明什么啊……

我认为楼主只需要拿出一个数据即可：kit第一次沉淀下来的东西里，外泌体占的百分比，第二次kit沉淀时外泌体占的百分比，超离分离法得到的沉淀，外泌体所占的百分比（可以以粒子数/微克蛋白表示，也可以用wb上样一样多的蛋白杂marker看亮度表示）。这个数据就完全可以解释 到底kit沉淀法有没有沉淀出大量的杂蛋白。 （这才是最直接的证据，而其他的东西都或多或少带有主观推断）

咱俩争论来争论去，这个数据才是最重要的。 (Lobb RJ Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma, J Extra Vesc, 2015)这篇paper里已经做过第一次沉淀的比较了。你只要做一下第二次的比较即可。 或者你可以通过数据推翻这篇paper的结论 也可以的~

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作者: Izon    时间: 2015-10-26 18:19
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽

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作者: evomicscience    时间: 2015-10-26 21:04
多谢两位精彩的体会。peg几十年前就用于沉淀病毒颗粒，极易共沉淀疏水蛋白和脂类小颗粒，如LDL等。SBI最早用它浓缩exosome，确实推进了本学科的发展。由于问题多多，如收率和纯度，是时候重新考虑慎用它抽提exosome，特别是发文章用。考虑到收率，可以外加高度纯化的标记的exosome 到你要抽提的溶液中 spike_in 的方法，看最后恢复多少exosome. 分离纯化是讲收率和纯度。exosome的纯化应结合它的密度和大小。SEC 是目前最优的方法。

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作者: yy8651    时间: 2015-10-27 10:15
看到争鸣才最有用，这才是讨论。
感觉两位都有道理
但是有个问题
超离确实费时间又费钱，特别是用含血清培养基的时候，去exosome步骤会浪费一部分血清，超离上机又要耗费大量的培液，这个时间成本和劳动成本都巨高
所以我赞同楼上关于如果做核酸分析试剂盒还是可以的，也赞同功能实验还是应该超离
但是做蛋白分析，我感觉还是超离吧，最好能密度梯度，因为试剂盒真的可能是杂蛋白比较多

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作者: seallin    时间: 2015-10-27 11:55

yy8651 发表于 2015-10-27 10:15
看到争鸣才最有用，这才是讨论。
感觉两位都有道理
但是有个问题

这样才能促进大家认知的提高。诚然，目前的策略不适合做蛋白分析，不过通过优化实验方案，如果能两次沉淀，杂蛋白会大大降低，我的跑胶结果最后显示几乎没有血清蛋白如白蛋白和转铁，而如果仅仅进行一次的话（就是试剂盒protocol的策略）还是有很多血清蛋白残留的。我就是做蛋白大规模鉴定的，按照谱图计数表征蛋白相对含量，白蛋白差不多只能排到38位，说明大部分的血清蛋白都被去除了

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作者: 惜名    时间: 2015-10-27 14:03
你用SBI提取exo做蛋白质谱的么？
第一次提取重悬后再次加EXO-QUICK重悬么？

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作者: seallin    时间: 2015-10-27 17:04

惜名 发表于 2015-10-27 14:03
你用SBI提取exo做蛋白质谱的么？
第一次提取重悬后再次加EXO-QUICK重悬么？

不过不是用SBI提取的，是自己加聚合物提取的。第一次沉淀后去除上清，加水或PBS重溶，再加一定比例的聚合物，再次沉淀，这下就纯很多了

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作者: hzangs    时间: 2015-10-27 18:05

seallin 发表于 2015-10-27 17:04
不过不是用SBI提取的，是自己加聚合物提取的。第一次沉淀后去除上清，加水或PBS重溶，再加一定比例的聚合 ...

其实 我还是建议楼主去考察一下   粒子数/蛋白 这个值，  这个反映比较直观，说服力也比较强。

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作者: seallin    时间: 2015-10-27 21:20

hzangs 发表于 2015-10-27 18:05
其实 我还是建议楼主去考察一下   粒子数/蛋白 这个值，  这个反映比较直观，说服力也比较强。 ...

如果我是你们一线城市就好了，上次去测NTA都是从东北飞到上海去测的，第三次报销的时候看老师脸都绿了。。谢谢你的建议，我会进一步完善之

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作者: hzangs    时间: 2015-10-27 21:32

seallin 发表于 2015-10-27 21:20
如果我是你们一线城市就好了，上次去测NTA都是从东北飞到上海去测的，第三次报销的时候看老师脸都绿了。 ...

你可以联系一下izon 或者 nanosight，已合作的方式，到时候发文章方法里写一下的形式体现合作，也许他们可以免费给你测呢~  邮递样品就可以。  我找izon的qNano测粒子浓度的时候 就是邮递过去的，冰袋加厚泡沫盒就行的~~

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作者: 惜名    时间: 2015-10-28 09:02

seallin 发表于 2015-10-27 17:04
不过不是用SBI提取的，是自己加聚合物提取的。第一次沉淀后去除上清，加水或PBS重溶，再加一定比例的聚合 ...

OK  我也试试用SBI二次提取~

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作者: seallin    时间: 2015-10-28 09:28

惜名 发表于 2015-10-28 09:02
OK  我也试试用SBI二次提取~

血清如果能离心彻底，SBI提取的量不会很多。因为沉降系数是以时间表示的。

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作者: 惜名    时间: 2015-10-28 09:34

seallin 发表于 2015-10-28 09:28
血清如果能离心彻底，SBI提取的量不会很多。因为沉降系数是以时间表示的。 ...

我的培养基是无血清培养基，所以不担心血清exo污染。

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作者: seallin    时间: 2015-10-28 10:17

hzangs 发表于 2015-10-27 21:32
你可以联系一下izon 或者 nanosight，已合作的方式，到时候发文章方法里写一下的形式体现合作，也许他们 ...

有点疑问，文献他们用的仪器是TRPS（qnano的），测量粒径的时候单位是1E11 particles/mL，这太高了吧，我们一般用马尔文的仪器（NanoSight）测粒径，单位一般都是1E6-E8 particles/mL的，见那篇nature，再高就不准了。不知同样的样品仪器是否会有误差

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作者: onlyrush    时间: 2015-10-28 10:58
PEG沉淀的方法以前用于病毒的浓缩，我的实验也显示，在有病毒粒子存在的情况下Life的试剂盒把exosomes与病毒粒子一起沉淀了下来，这点至少说明PEG沉淀对颗粒的选择是根据浮力密度或者颗粒大小或者其他因素，并无非常特异的选择性，试剂盒沉淀肯定包含exosomes但是绝不仅仅是exosomes。

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作者: hzangs    时间: 2015-10-28 11:15

seallin 发表于 2015-10-28 10:17
有点疑问，文献他们用的仪器是TRPS（qnano的），测量粒径的时候单位是1E11 particles/mL，这太高了吧，我 ...

对不起刚刚发出的帖子  我感觉有点不妥当，所以对一些数值进行修正。考虑到A549平铺在培养皿中是50um，球形的状态不好估算，所以我们按照真核细胞平均直径计算吧。

真核细胞的平均直径在30um。 exosome的直径我们取一个比较大的值100nm，也就是0.1um。真核细胞直径就是exosome的300倍，面积就是90000倍，体积就是27000000倍。也就0.27 E8 倍.

那么 E8的exosomes的体积不及4个真核细胞。  试想，我们能隔着离心管壁看到4个沉淀在管底的细胞么？

我60ml 培液收到的exosomes，200um的体积重悬，测粒子数在E11左右， 体积也仅仅相当于不到4000个细胞。考虑到我在离心管底部看到的芝麻大小薄薄的一层沉淀。这里的数据属于估算，真实情况可能存在出入 但是足以说明问题。所以我感觉E11的值属于正常，反而E6-E8有点偏小了

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作者: hzangs    时间: 2015-10-28 11:18

onlyrush 发表于 2015-10-28 10:58
PEG沉淀的方法以前用于病毒的浓缩，我的实验也显示，在有病毒粒子存在的情况下Life的试剂盒把exosomes与病 ...

PEG促沉淀 一般考虑是它竞争性结合游离水

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作者: onlyrush    时间: 2015-10-28 11:40

hzangs 发表于 2015-10-28 11:18
PEG促沉淀 一般考虑是它竞争性结合游离水

我记得不同浓度和不同分子量的PEG用来沉淀不同分子量的蛋白，我觉得用于沉淀exosomes的PEG对于目标颗粒或者蛋白聚合物的选择也是一个范围吧

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作者: evomicscience    时间: 2015-10-28 14:54
是的，因为peg 或类似的多聚物吸疏。它们广泛地用于病毒，蛋白质等疏水物的富集，甚至蛋白蛋结晶的生长。

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作者: seallin    时间: 2015-10-28 15:11

hzangs 发表于 2015-10-28 11:15
对不起刚刚发出的帖子  我感觉有点不妥当，所以对一些数值进行修正。考虑到A549平铺在培养皿中是50um，球 ...

你的例子还有数值很有道理，请问你60ml培养液最后得到多少微克蛋白？另外马尔文的仪器在测试的时候，一旦浓度超过1E9就不线性了，而你的样品测到了1E11，是样品稀释了至少100倍吧？

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作者: Izon    时间: 2015-10-28 15:30
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作者: seallin    时间: 2015-10-28 15:44

Izon 发表于 2015-10-28 15:30
你的这个数据是颗粒浓度，不是粒径吧。

关于颗粒浓度，手上正好有几张图，大家可以比较一下：

测试参数的不同，确实会有所差别，不过貌似不会有数量级上的差别吧

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作者: Izon    时间: 2015-10-28 15:59
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作者: seallin    时间: 2015-10-28 16:14

Izon 发表于 2015-10-28 15:59
结果都是用100nm+200nm标准样品1：1配好来测的。应该了解一下这个“浓度”是怎么“测”出来的，跟什么有关 ...

我知道，和斯托克斯方程有关，系数不一样，最后的浓度就不一样啦

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作者: Izon    时间: 2015-10-28 16:42
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作者: seallin    时间: 2015-10-28 16:45

Izon 发表于 2015-10-28 16:42
还有光源，photo detector, 颗粒对光的scattering，大颗粒的影响，溶液离子强度等。反正要是 ...

和文献对比可能会出现参数不同的问题，但是不至于差好几个数量级。但是自己的横向对比因为参数一致，所以这点影响可以忽略不计

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作者: Izon    时间: 2015-10-28 16:54
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作者: hzangs    时间: 2015-10-28 17:48

seallin 发表于 2015-10-28 15:11
你的例子还有数值很有道理，请问你60ml培养液最后得到多少微克蛋白？另外马尔文的仪器在测试的时候，一旦 ...

这个涉及到了我们细胞系的特性和后面发表时候的相关数据，所以具体细节不便透露，还请见谅。 因为不是用的马尔文的仪器，所以不存在1E9这个界限。确实稀释了，但是稀释倍数也只能暂且保密，毕竟我已经将粒子数的数据放出来了。 还望见谅

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作者: seallin    时间: 2015-10-28 19:50

Izon 发表于 2015-10-28 16:54
有机会的话，你稀释一个浓度梯度测测看，看能不能给你一个意外的结果。

不过目前国内关注外泌体准确定量 ...

对，很有道理，不过方法也是为应用服务的

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作者: seallin    时间: 2015-10-28 20:20

hzangs 发表于 2015-10-28 17:48
这个涉及到了我们细胞系的特性和后面发表时候的相关数据，所以具体细节不便透露，还请见谅。 因为不是用 ...

理解，不知除了Lobb那篇，还有哪些文献是用粒子数/蛋白量这个指标的，可否推荐几篇文献，非常感谢

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作者: hzangs    时间: 2015-10-28 20:43

seallin 发表于 2015-10-28 20:20
理解，不知除了Lobb那篇，还有哪些文献是用粒子数/蛋白量这个指标的，可否推荐几篇文献，非常感谢 ...

你要是有更好的反应exosomes样品中exosomes纯度的指标 也行 呵呵

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作者: seallin    时间: 2015-10-28 21:37

hzangs 发表于 2015-10-28 20:43
你要是有更好的反应exosomes样品中exosomes纯度的指标 也行 呵呵

我也没有其他指标，文献看的也不多，因为目前我只发现lobb那篇文献提出了那个指标，所以想请教一下你，是否还有其他文献也用了这个指标。我只是虚心的请教，希望你别介意。

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作者: meme    时间: 2015-10-28 22:19

hzangs 发表于 2015-10-26 15:07
很高兴能和你交流这些东西。

请问 有尝试过将kit沉淀的东西重新溶解然后再用kit沉淀一遍么， 结果如何， ...

想问一下 free-exo的培养基是超离培养基，还是超离血清呀？

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作者: meme    时间: 2015-10-28 22:25

惜名 发表于 2015-10-28 09:34
我的培养基是无血清培养基，所以不担心血清exo污染。

小白问一下，无血清的培养基养什么细胞啊？

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作者: 惜名    时间: 2015-10-29 10:52

meme 发表于 2015-10-28 22:25
小白问一下，无血清的培养基养什么细胞啊？

http://www.exosome.com.cn/forum. ... amp;_dsign=612f3be4

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作者: hzangs    时间: 2015-10-29 12:02

seallin 发表于 2015-10-28 21:37
我也没有其他指标，文献看的也不多，因为目前我只发现lobb那篇文献提出了那个指标，所以想请教一下你，是 ...

毕竟我们两个人的数据都没办法秀到坛子里。 确实想学习研究一下楼主的优化后的沉淀法的protocol，看看优化后的结果， 等楼主的paper投出去后 还请楼主发一下链接，到时候大家都可以拜读一下，学习一下

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作者: seallin    时间: 2015-10-29 13:25

hzangs 发表于 2015-10-29 12:02
毕竟我们两个人的数据都没办法秀到坛子里。 确实想学习研究一下楼主的优化后的沉淀法的protocol，看看优 ...

恩，这是应该做的。对了，粒子数/蛋白量这个指标是不是只有Lobb用过，我承认这是个好方法，是否还有其他文献，你貌似一直在避开回答这个问题。谢谢~~

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作者: hzangs    时间: 2015-10-29 13:42

seallin 发表于 2015-10-29 13:25
恩，这是应该做的。对了，粒子数/蛋白量这个指标是不是只有Lobb用过，我承认这是个好方法，是否还有其他 ...

你一直在强调自己的二次沉淀法分到的exosomes样品很纯， 也承认粒子数/蛋白量是个好方法。你有没有试着去测一下你二次沉淀样品中的这个指标和超离是不是有差别呢？  你貌似一直在试图躲避这个测试啊  呵呵

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作者: seallin    时间: 2015-10-29 14:59

hzangs 发表于 2015-10-29 13:42
你一直在强调自己的二次沉淀法分到的exosomes样品很纯， 也承认粒子数/蛋白量是个好方法。你有没有试着去 ...

算了，到此为止，我

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作者: Izon    时间: 2015-11-9 16:58
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽

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作者: guomengzhou    时间: 2015-12-6 21:18

seallin 发表于 2015-10-26 15:46
我也很高兴能与您探讨！
再来一遍的话，如果跑胶对比，可以明显发现60-70kDa的条带变浅了很多，因为血清 ...

感谢楼楼提供的方法，我也在做60-70kda的条带。想请问下重溶后再加kit的量是多少了？譬如用50ul的PBS重溶，是不是只需加四分之一也就是12ul的kit就够了？多谢

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作者: seallin    时间: 2015-12-7 14:02

guomengzhou 发表于 2015-12-6 21:18
感谢楼楼提供的方法，我也在做60-70kda的条带。想请问下重溶后再加kit的量是多少了？譬如用50ul的PBS重溶 ...

比例按照提供的体积比即可

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作者: guomengzhou    时间: 2015-12-7 14:07

seallin 发表于 2015-12-7 14:02
比例按照提供的体积比即可

好的，谢谢！

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作者: 哈利郭特    时间: 2016-1-19 12:29

hzangs 发表于 2015-10-28 11:15
对不起刚刚发出的帖子  我感觉有点不妥当，所以对一些数值进行修正。考虑到A549平铺在培养皿中是50um，球 ...

握爪！相见恨晚啊！
你的观点我全部赞同！
如果觉得 粒子数/蛋白量 不方便测的话，最简单的其实可以提个RNA，做个qPCR，然后用同一个RNA的量/蛋白量（比如U6/蛋白量）。
我之前用21ml培养基充分混匀，20ml用超速离心的方法，1ml用试剂盒的方法，提exosomes。1ml试剂盒有大量沉淀，而超速离心根本看不到沉淀，加入trizol，提RNA，qPCR检测U6含量，20ml超离是1ml试剂盒的16倍多，而1毫升试剂盒的沉淀却是一大坨而20ml超离根本看不到，可见有多少杂蛋白。（我用的是life的试剂盒），另外，我用10%的血清（超离18h）不加任何细胞依然可以看到大坨沉淀，可能楼主自己配的PEG更科学吧。
另外特别想请教下hzangs，你们用exosomes处理细胞的时候是用多少ml的培养基的exosomes呀？我看文章上边用量各式各样，用太多了我又觉得不能反映真实情况，太少了没变化，特来请教！

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作者: hzangs    时间: 2016-1-19 16:41

哈利郭特 发表于 2016-1-19 12:29
握爪！相见恨晚啊！
你的观点我全部赞同！
如果觉得 粒子数/蛋白量 不方便测的话，最简单的其实可以提个R ...

我之前 做的时候，基本上是用2-3ug protein exosomes / well  24孔板，基本上相当于10^6的细胞的量。o(╯□╰)o    我也不知道我的用量是不是合适。。。

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作者: Izon    时间: 2016-2-18 11:46
提示: 作者被禁止或删除 内容自动屏蔽

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作者: Mxiansheng    时间: 2016-2-18 15:55
haodongdong

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作者: william    时间: 2017-3-31 22:40
建议你德国ZetaView看一下你用试剂盒得到外泌体的浓度、颗粒粒径、杂质情况。

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作者: husthuagai    时间: 2017-7-2 16:05
真的学到了很多

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作者: ucsandiego    时间: 2017-7-30 17:46

hzangs 发表于 2015-10-26 16:50
目前我不建议大家用沉淀试剂盒分离的最主要原因有二：
1、我曾经将life的试剂盒沉淀的所谓的外泌体和超离的 ...

您好，我想请教下你们所说的life的试剂盒就是thermo fisher旗下的invitrogen的试剂盒吗，因为我搜索life technologies就搜索到thermo，而且thermo里的外泌体试剂盒只有invitrogen这个牌子，谢谢解答！

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作者: hzangs    时间: 2017-7-31 09:41

ucsandiego 发表于 2017-7-30 17:46
您好，我想请教下你们所说的life的试剂盒就是thermo fisher旗下的invitrogen的试剂盒吗，因为我搜索life  ...

thermo 收购了 invitrogen       life 收购了 thermo

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作者: ucsandiego    时间: 2017-7-31 12:03

hzangs 发表于 2017-7-31 09:41
thermo 收购了 invitrogen       life 收购了 thermo

哦 好，但是我查到的新闻都是说thermo收购了life啊。。不过反正就是invitrogen那种试剂盒吧，Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)就是这个，瓶子的商标是invitrogen把，因为最近要开展外泌体相关试验，所以在了解这些试剂盒，谢啦

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作者: ucsandiego    时间: 2017-7-31 12:22

hzangs 发表于 2017-7-31 09:41
thermo 收购了 invitrogen       life 收购了 thermo

还得请教您一个问题，在一个帖子中听说您用qev的柱子提取外泌体得到了较好的结果，我想问下qev用得到超离吗？还有这种方法是不是提取的外泌体杂蛋白较少，也就是说会比SBI的试剂盒好些呢，谢啦

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作者: ucsandiego    时间: 2017-7-31 12:31

ucsandiego 发表于 2017-7-31 12:03
哦 好，但是我查到的新闻都是说thermo收购了life啊。。不过反正就是invitrogen那种试剂盒吧，Total Exoso ...

哈哈，又来了，我想得到较纯的外泌体（不含杂蛋白），qev这个试剂盒是不是就是一个柱子啊（我现在研一，没怎么接触过这方面的实验，见谅），会不会用到其他什么仪器呢，我刚才查了下这个产品，原理就是一个70nm的孔，可以把比外泌体小的杂蛋白过滤掉，也就是说如果我先用sbi试剂盒得到外泌体，在用qev纯化就可以得到较纯的外泌体了吗，多谢师兄哈，我这面没人做过外泌体，只能在网上请教大家了，多谢啦

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作者: hzangs    时间: 2017-8-1 11:31

ucsandiego 发表于 2017-7-31 12:31
哈哈，又来了，我想得到较纯的外泌体（不含杂蛋白），qev这个试剂盒是不是就是一个柱子啊（我现在研一， ...

老老实实超离吧。  别的都不是很靠谱

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作者: ucsandiego    时间: 2017-8-1 13:01

hzangs 发表于 2017-8-1 11:31
老老实实超离吧。  别的都不是很靠谱

好的，多谢师兄，我现在再查超离的protocol，有什么靠谱的文献给推荐下呗，还有师兄我加入你说的那个qq群了，还没同意我加入呢，求批准

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作者: gj417439623    时间: 2017-8-23 17:18
各位前辈，刚开始接触外泌体，我想用人的血清提取外泌体，后面涉及RNA和蛋白质测序，暂时不涉及更深入机制。这样的话到底是选超离法呢还是试剂法合适呢？然后，除了SBI的EXOquick试剂盒，我还看到有人用Qiagen 的kit试剂盒，请问这两种方法是否都是基于PEG沉淀法的？那是不是杂蛋白就比较多了？
还有，之前各位前辈的讨论我都看了，一直再说的那个 粒径/蛋白 的这个值，是用nanosight鉴定得到的是么?这个值更体现exosome的纯度么？
谢谢前辈！

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作者: wangjiachen    时间: 2017-11-6 11:13

gj417439623 发表于 2017-8-23 17:18
各位前辈，刚开始接触外泌体，我想用人的血清提取外泌体，后面涉及RNA和蛋白质测序，暂时不涉及更深入机制 ...

请问楼主，你的问题解决了么？你最后订的什么试剂盒，结果怎么样呢？

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作者: gj417439623    时间: 2017-11-15 16:32

wangjiachen 发表于 2017-11-6 11:13
请问楼主，你的问题解决了么？你最后订的什么试剂盒，结果怎么样呢？

没有 现在才刚开始做了预实验 选择了超离法  还有很多问题

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作者: lunan3067280    时间: 2018-1-26 12:46
PEG沉淀，包括商品化的试剂盒有缺点，但是可以避免的。有些楼层说PEG沉淀出来一大坨沉淀，当你用无血清的培养上清加PEG沉淀是绝对看不到的，之前有文献已经说明了，exo-free 血清的培养基里面有大量的脂蛋白，  如果加PEG沉淀出来的必然是那一大坨脂蛋白。再次我不建议使用exo-free的血清培养基，你用超离，用SEC也会将带有脂蛋白污染，用PEG更不行。
PEG适用于无血清培养基的小囊泡分离。 首先无血清培养基里面只有小分子化合物，经过细胞培养后，细胞分泌的物质主要是小蛋白以及各种囊泡，除非细胞特异，一般不会有脂蛋白产生。及时PEG能够把左右的东西沉淀下来，其中物质包括了囊泡和小蛋白。   那么我们可以通过方法减少小蛋白的污染，这时候用到的就是超滤。功能性的小蛋白主要都是50KDa以下，细胞因子，趋化因子都在10kD左右，你用100KD，甚至300KD 等的超滤管浓缩后，大量的小蛋白被除去，如果在浓缩后加上PBS洗，再浓缩，理论上可以将小蛋白基本除去，毕竟你用的100kD的滤膜，除非堵塞很严重。上面在某些步骤加上0.22过滤。

当你把小蛋白除去以后，在用PEG沉淀，这时候沉淀的主要就是小囊泡，期间可能会有一些蛋白聚合物，但是细胞培养一般不会分泌太大的大分子蛋白，聚合起来也不会特别大。 所以得到的囊泡是比较纯的。  除非有人告诉我你无血清里面还有其他我没提到的物质。

我建议大家都不要在使用exo-free的血清培养基来分离外泌体，里面太多的脂蛋白了，通过超离是离心不完全的，特别是用任何沉淀法的时候。

总之，PEG可以沉淀下来蛋白，那么我们提前避免培养上清里面有过多的蛋白，并且预先讲其除去呢？那样沉淀下来的不就是我们想要的了么！ 上面所说的细胞都是以不产生病毒颗粒的细胞。

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作者: dongdongdong    时间: 2019-3-15 15:25

william 发表于 2017-3-31 22:40
建议你德国ZetaView看一下你用试剂盒得到外泌体的浓度、颗粒粒径、杂质情况。 ...

看文献上都是用的nanosight,德国ZetaView怎么样呢

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作者: WinterBlinder    时间: 2021-5-16 21:00
感谢分享，收获很大

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