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标题: 关于 沉淀分离试剂盒 的几点质疑 [打印本页]

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作者: hzangs    时间: 2015-10-26 20:18
标题: 关于 沉淀分离试剂盒 的几点质疑


从事exosomes相关的课题已经一年半了，期间走了不少弯路，尝试过各种各样的分离方法，最后为我们实验室建立了以超速离心为基础的分离鉴定exosomes的成套方法。
最近有些从事exosomes相关研究的新朋友在问，使用试剂盒分离exosomes，发paper的时候杂志认不认。这确实是一个很头疼的问题，既然有人开始问了，那我就略微整理一下自己的一些看法与大家分享。我使用过的分离方法主要有三种，分别是life试剂盒（与SBI类似，PEG-base的沉淀法）、凝胶排阻层析和超速离心分离。凝胶排阻层析与超速离心的对比已经在我之前的帖子中有过总结，在这里不再赘述。这次主要是想和大家分享讨论一下 类似于life、SBI等沉淀分离exosomes的方法存在的一些问题。目前我仅使用过life的exosomes沉淀分离的试剂盒，所以在这里只以life的试剂盒为例。

我认为life这种沉淀法的试剂盒主要是一下几方面问题：
1、试剂盒沉淀法收到的沉淀量很大。相同体积的培液，目测估计 试剂盒沉淀法通常是超离分离法沉淀量的十几倍甚至上百倍。（有朋友提出质疑“可能是超速离心 2小时 分离时培液中还有exosomes没有沉淀下来，因此是超离分离不充分而不是试剂盒沉淀分离的问题”，针对这个假设，我之前是做过实验的，110,000g超速离心70min 的培液，取上清继续超离70min，是看不到任何沉淀的，说明超速离心分离是比较充分的）

2、试剂盒沉淀法沉淀中蛋白含量十分高。相同体积的培液，试剂盒沉淀通常收到的蛋白量会是超离分离法得到的沉淀量的几十倍。（有朋友提出质疑“沉淀未经PBS洗涤，所有可能有杂蛋白，洗涤后再用试剂盒沉淀，沉淀量看上去会小”，这个我认为洗涤之后再用试剂盒沉淀下来，确定 粒子数/微克蛋白 的值 与超速离心分离的结果作对比 才有参考意义。其他方法或多或少都有主观臆断的情况）

3、文献报道显示，试剂盒沉淀法通过粒子浓度检测 单位用 粒子数/微克蛋白时，试剂盒沉淀法每微克蛋白所含粒子数低于超离分离法很多。（这是说明试剂盒沉淀法的沉淀中带有大量杂蛋白的一个证据）

4、我使用试剂盒沉淀得到的所谓的exosomes和超离的到的exosomes同时分别处理细胞，用于试验。试剂盒沉淀得到的所谓exosomes出现了假阳性结果。（按照我的数据分析，这说明试剂盒沉淀法中的杂蛋白确实会影响表型，恰恰支持了后文中reviewer提出的质疑）

有朋友说，试剂盒做出来的有问题是因为操作不熟练。但是我想说，这个试剂盒的要求很简单，不可能是操作问题。而且，如果一个试剂盒都要非常精准的操作，还要反复练习，那这个试剂盒还有什么意义呢？这个观点我真的不敢苟同。

另外，惜名师兄的案例也已经说明，现在使用试剂盒沉淀分离exosomes是有可能受到reviewer的质疑的。该案例中reviewer直指一个致命的问题：试剂盒沉淀得到的exosomes样品 其粒子数/微克蛋白要明显低于超速离心法，说明沉淀中有大量的蛋白不是exosomes中的，那么使用这种exosomes样品处理细胞带来的表型，有可能是杂蛋白引起的，所以实验不严谨。这篇paper（Lobb RJ Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma, J Extra Vesc, 2015）里对沉淀法和凝胶排阻以及超离分离法的对比，确实证实沉淀法中存在大量的杂蛋白。

综合上面一些我遇到的和坛友遇到的问题，可以看出，现在试剂盒沉淀法还存在非常多的问题。在后期投稿时还是很可能被argue的。因此 我认为大家在前期制备exosomes样品是还是要慎重选择分离方法，尽可能使用超速离心的方法，而慎重选择试剂盒提供的沉淀法。
（今天事情比较多，后面我会逐渐完善我使用life的kit的时候 遇到的上面几方面问题）

非常愿意和大家对此事进行讨论

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作者: 惜名    时间: 2015-10-27 09:32


终于，这个问题被正面提出了。我来搅几棍。
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鄙人实验室早期一直使用101bio，后来觉得步骤繁琐逐渐使用SBI。前段时间师兄投稿，被reviewer质疑（就是楼主写的那段话），我请Johhny用他们的超离方法帮我做过一次。因此，我算是3种方法都用过了。。。

先上我的干货：
1、101bio、SBI、超离，三种方法提的“exosome”我都做了功能实验，也就是用exo干预靶细胞、观察表型。三种方法得到了一样的结果。
2、来说说得到的exosome蛋白量，101bio和SBI得到的蛋白量差不多，但是这二者是超离的10-20倍左右。
3、pkh67-exo的摄取实验，我做了101bio和SBI的，都能看到靶细胞摄取pkh67-exo。
4、电镜：101bio得到的图是圆形空泡的（见我早期的帖子），SBI得到的是比较理想的图。当然，这个区别也可能是样本制备导致的。我前后做了5次电镜，深深觉得电镜室老师的样本制备技术是关键关键关键啊！！！

来说说那篇JoEV：Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma。在这篇文献中，头对头比较了SBI、exospin（不知道哪个公司的）、qEV和密度梯度离心4种方法的优劣。
粒子直径方面：SBI、exospin、qEV得到的直径、形态类似，但是和密度梯度相比多了些>200nm的颗粒
粒子数/每mg蛋白方面：以SBI为1单位，目测exospin、qEV、密度梯度分别为3、12、7，结合western跑蛋白marker的亮度，作者认为SBI提取的exo存在大量其他蛋白的污染。
上面的数据都是细胞上清中的exo，如果用血清来比较，SBI的数据更难看（声明：我和SBI无任何利益关系）

-----------------来个悲伤的分割线-------------------------
我做了3个和exo相关的小方向，其中1个已经投文章了（3.2分，求不要嘲笑）。另外2个正在做。静待reviewer是否会纠结我用的的方法。。。
当然，我已经想好了托辞：本文主要研究exo中的miRNA，因此蛋白污染即使有，也不影响我们对miRNA 的研究。我们可以在limitation中对所用方法进行讨论。

未来打算尝试下qEV，纵观hzangs的数据，和JoEV的结论，qEV的表现简直逆天（声明：我和IZON无任何利益关系）。

---“啥，你问我为啥不用超离？”
---“嗯，这个问题很好”

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作者: hzangs    时间: 2015-10-27 09:46

惜名 发表于 2015-10-27 09:32
终于，这个问题被正面提出了。我来搅几棍。
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鄙人实验室早期一直 ...

我来回答最后一个问题。  因为你们没有超离机器

托辞写的也可以。 不过建议你用去除掉exosomes的上清液重复一下你的表型实验，如果是阴性的，那就说明表表型不是上清液里的游离蛋白或者杂蛋白带来的，大概也就封住reviewer的嘴了  o(╯□╰)o

预祝顺利啊

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作者: hereissyk    时间: 2015-10-27 13:58
今天实验室的超离机报了好多次错，吓得我来看看试剂盒。。。

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作者: 咏咩咩    时间: 2015-11-16 19:13

惜名 发表于 2015-10-27 09:32
终于，这个问题被正面提出了。我来搅几棍。
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鄙人实验室早期一直 ...

请问蛋白污染真的不会影响miRNA的提取嘛?
我做的是尿液EV..可能会有比较多的Tamm-Horsfall 蛋白(THP)..说是会把囊泡缠绕在一起..
如果不除THP对RNA提取会有影响嘛?

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作者: 丝瓜    时间: 2015-11-16 20:02
悲催的中心实验室的超速离心机坏掉了- -太贵人家不舍得修...
话说我是做蛋白的，走投无路现在只能打算用qEV，也在努力找机会跟超高速比一比，为了将来被质疑的时候有话可说啊- -
可是不用超高速还是心慌慌...
exosome说实话真是小小的囊泡大大的坑，我们都还在坑底- -
惜名大大都已经发了文章了真心太棒了！！！

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作者: 丝瓜    时间: 2015-11-17 10:37

Johnny 发表于 2015-11-16 22:47
这位兄台表激动。。

伤心之情无以复加= =
整个人都是不好不好的...
可还是在为毕业努力奋斗着！！

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作者: 子非鱼    时间: 2015-12-18 13:48

惜名 发表于 2015-10-27 09:32
终于，这个问题被正面提出了。我来搅几棍。
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鄙人实验室早期一直 ...

我居然没看这个帖子，已经买了2个SBI打算提取血清exosome......估计要糟糕了

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作者: hzangs    时间: 2015-12-18 19:25

子非鱼 发表于 2015-12-18 13:48
我居然没看这个帖子，已经买了2个SBI打算提取血清exosome......估计要糟糕了 ...

别紧张。 只是目前存在质疑。  其实论坛里用SBI的朋友 也不少

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作者: 子非鱼    时间: 2015-12-22 11:01

hzangs 发表于 2015-12-18 19:25
别紧张。 只是目前存在质疑。  其实论坛里用SBI的朋友 也不少

先谢谢你的鼓励，我只能试试了。

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作者: Mxiansheng    时间: 2016-2-24 17:26

咏咩咩 发表于 2015-11-16 19:13
请问蛋白污染真的不会影响miRNA的提取嘛?
我做的是尿液EV..可能会有比较多的Tamm-Horsfall 蛋白(THP)..说 ...

您的尿液miRNA结果怎么样了？顺利吗？

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作者: 咏咩咩    时间: 2016-2-25 20:48

Mxiansheng 发表于 2016-2-24 17:26
您的尿液miRNA结果怎么样了？顺利吗？

我后来还是做了除THP的步骤.但是miRNA还没跑.

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作者: JimmyH    时间: 2016-4-25 23:27

hzangs 发表于 2015-10-27 09:46
我来回答最后一个问题。  因为你们没有超离机器

托辞写的也可以。 不过建议你用去除掉exosomes的上 ...

想请问如何去除掉上清液中的exosome？如果是用提取的方法，可以被认为是上清中的有效成分被一起提取掉了，因此无效。如果是破坏exosome的话，可以是因为exosome中的内含无被释放到上清中了，请问前辈是如何处理的？十分感谢！

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作者: hzangs    时间: 2016-4-26 09:56

JimmyH 发表于 2016-4-25 23:27
想请问如何去除掉上清液中的exosome？如果是用提取的方法，可以被认为是上清中的有效成分被一起提取掉了 ...

目前没有太好的方法，只能是按照提取exosome的方法来去除上清中的exosome。

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