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标题: 外泌体测不出浓度怎么办？ [打印本页]
作者: 毛毛    时间: 2015-11-19 16:50
标题: 外泌体测不出浓度怎么办？
超速离心提取的HEK293细胞外泌体，用CD63做western检测，条带很清晰，但是用BCA试剂盒或者OD280测浓度都显示为零或负值，外泌体用RIPA（强效）裂解后再测，还是测不出来，大家有过这样的经历吗？求指点！
作者: zqy2002    时间: 2015-11-19 19:47
对照组调零有差错吧
作者: kasangzc    时间: 2015-11-20 09:06
你做WB的时候  外泌体直接上样 不先进行裂解吗？
作者: 毛毛    时间: 2015-11-20 13:35
kasangzc 发表于 2015-11-20 09:06
你做WB的时候  外泌体直接上样 不先进行裂解吗？

做WB时候，外泌体用PBS溶解后直接加SDS-PAGE loading Buffer，100度变性5min，上样。
作者: 毛毛    时间: 2015-11-20 13:37
zqy2002 发表于 2015-11-19 19:47
对照组调零有差错吧

对照组调零应该没有问题。
作者: kasangzc    时间: 2015-11-20 16:47
毛毛 发表于 2015-11-20 13:35
做WB时候，外泌体用PBS溶解后直接加SDS-PAGE loading Buffer，100度变性5min，上样。 ...

还原还是非还原呢？
作者: zqy2002    时间: 2015-11-20 23:42
毛毛 发表于 2015-11-20 13:35
做WB时候，外泌体用PBS溶解后直接加SDS-PAGE loading Buffer，100度变性5min，上样。 ...

同意，不需要裂解
作者: zqy2002    时间: 2015-11-20 23:44
毛毛 发表于 2015-11-20 13:37
对照组调零应该没有问题。

既然BCA测试都出现负数了，你说应不应该对照组出错。否则你用水测试一下看是不是负值。
作者: 毛毛    时间: 2015-11-24 21:59
感谢各位战友的热心帮助，浓度问题已解决，是由于外泌体浓度较低，超出了BCA试剂盒的检测范围，换成灵敏度更高的试剂盒就好了。希望能对遇到类似问题的战友有所帮助。
作者: 子非鱼    时间: 2015-12-11 21:29
毛毛 发表于 2015-11-20 13:35
做WB时候，外泌体用PBS溶解后直接加SDS-PAGE loading Buffer，100度变性5min，上样。 ...

我看最近的一篇文献，exosome提出来直接就去测浓度了，而且做HPLC-MS貌似都是直接做的，不经过提蛋白，看你这也是这么直接，难道真的可以？请问，你这个步骤有没有文献支持啊？求分享~~
作者: liuhaoisboy    时间: 2015-12-13 10:38
建议楼主也能积极回答别人在你贴提问的问题。别人帮助了你，你要把这种热心传递下去。
作者: hzangs    时间: 2015-12-13 11:40
毛毛 发表于 2015-11-24 21:59
感谢各位战友的热心帮助，浓度问题已解决，是由于外泌体浓度较低，超出了BCA试剂盒的检测范围，换成灵敏度 ...

我们实验室用的天根的BCA kit   一般每次我会把10ul exosome溶液 load进去 测
作者: 毛毛    时间: 2015-12-14 13:15
liuhaoisboy 发表于 2015-12-13 10:38
建议楼主也能积极回答别人在你贴提问的问题。别人帮助了你，你要把这种热心传递下去。 ...

抱歉啊！最近两天没上网。
作者: 毛毛    时间: 2015-12-14 13:29
子非鱼 发表于 2015-12-11 21:29
我看最近的一篇文献，exosome提出来直接就去测浓度了，而且做HPLC-MS貌似都是直接做的，不经过提蛋白，看 ...

我没有找到裂解exosome再测浓度的文献，exosome表面有很多膜蛋白包裹，我觉得可以直接测，贴壁细胞分泌的量比较少，可能要用灵敏度高，测定范围微量的试剂盒，血清的就比较多，普通的蛋白浓度试剂盒都可以。
作者: 毛毛    时间: 2015-12-14 13:30
kasangzc 发表于 2015-11-20 16:47
还原还是非还原呢？

应该是还原的
作者: 子非鱼    时间: 2015-12-14 14:03
毛毛 发表于 2015-12-14 13:29
我没有找到裂解exosome再测浓度的文献，exosome表面有很多膜蛋白包裹，我觉得可以直接测，贴壁细胞分泌的 ...

多谢多谢！
作者: xing_dr0914    时间: 2018-1-9 21:40
同问楼主，buffer用的是还原的还是非还原的，看有的大佬说CD63需要用非还原的才行，所以不是很清楚。



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