外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 外泌体电镜拍出来是这样的，希望大家给点建议 [打印本页]
作者: zjm337    时间: 2015-11-27 13:55
标题: 外泌体电镜拍出来是这样的，希望大家给点建议
第一次分离外泌体，用超速离心的方法，最后重悬到PBS中，滴了20微升重悬液到铜网上自然晾干（半小时左右），又滴了20微升磷钨酸到铜网上自然晾干（半小时左右），然后过了一个小时拿去检测拍出来的TEM是这样的黑块。。。不知道问题出在哪，希望大家能给点建议。。。
作者: hzangs    时间: 2015-11-27 20:15
我们是将沉淀下来的exosomes 用少量的PBS 重悬，大概30ul。 然后10ul上样到铜网，沉淀1min，滤纸吸掉多余液体，然后醋酸双氧铀负染1min，滤纸洗掉多余液体。然后开始准备上电镜（上机前样品应该是晾干的，准备期间就足以晾干，大概在10min左右即可） 80-120kv成像即可。
作者: zqy2002    时间: 2015-11-27 20:37
楼主上图中未见到明确的exosome；倒数第二张图中是背景色，不是exosome。描述的染色方法错误。磷钨酸负染请参照我的其他回答帖子。
作者: zjm337    时间: 2015-11-28 11:44
hzangs 发表于 2015-11-27 20:15
我们是将沉淀下来的exosomes 用少量的PBS 重悬，大概30ul。 然后10ul上样到铜网，沉淀1min，滤纸吸掉多余液 ...

好的。。谢谢！
作者: zjm337    时间: 2015-11-28 11:48
zqy2002 发表于 2015-11-27 20:37
楼主上图中未见到明确的exosome；倒数第二张图中是背景色，不是exosome。描述的染色方法错误。磷钨酸负染请 ...

请问一下第一张和第二张里面的是不是也是背景色？没有产物？我是用了200ml上清超速离心，到最后有白色沉淀产生，用1mlPBS重悬，最后制样拍TEM，很奇怪为什么会没有东西呢？
作者: zqy2002    时间: 2015-11-29 19:29
也许第一二张片子里面白色底色是exosome也不一定。但目前不能看出来。
作者: 怒放的生命    时间: 2015-11-30 11:05
hzangs 发表于 2015-11-27 20:15
我们是将沉淀下来的exosomes 用少量的PBS 重悬，大概30ul。 然后10ul上样到铜网，沉淀1min，滤纸吸掉多余液 ...

请问你是用多少的培养上清沉淀下来的exosome呢？用30ul重悬。  大概蛋白能达到多少ug？
作者: hzangs    时间: 2015-11-30 11:47
怒放的生命 发表于 2015-11-30 11:05
请问你是用多少的培养上清沉淀下来的exosome呢？用30ul重悬。  大概蛋白能达到多少ug？ ...

100-150ml
作者: 怒放的生命    时间: 2015-11-30 17:03
hzangs 发表于 2015-11-30 11:47
100-150ml

多谢！在论坛里收获好大
作者: zjm337    时间: 2015-11-30 18:20
zqy2002 发表于 2015-11-29 19:29
也许第一二张片子里面白色底色是exosome也不一定。但目前不能看出来。

这是我今天新拍的TEM，感觉有点怪。。特别是第一第二张，请问这个是exosome吗？
作者: zqy2002    时间: 2015-11-30 20:08
最后一张圆圈有点像，但是这样的照片可能不能过编辑的那一关。还是让有经验的电镜室老师帮你把关。否则自己找出来根本不知道对不对。
作者: zjm337    时间: 2015-11-30 20:10
hzangs 发表于 2015-11-27 20:15
我们是将沉淀下来的exosomes 用少量的PBS 重悬，大概30ul。 然后10ul上样到铜网，沉淀1min，滤纸吸掉多余液 ...

可不可以帮我看看我今天新拍的TEM。。。总觉得怪怪的呢。。谢谢！
作者: zjm337    时间: 2015-11-30 20:14
zqy2002 发表于 2015-11-30 20:08
最后一张圆圈有点像，但是这样的照片可能不能过编辑的那一关。还是让有经验的电镜室老师帮你把关。否则自己 ...

哦哦。。好的。。想问问我第一张那种一个一个的是什么？？好奇怪。。而且很多。。
作者: zjm337    时间: 2015-11-30 20:23
zqy2002 发表于 2015-11-30 20:08
最后一张圆圈有点像，但是这样的照片可能不能过编辑的那一关。还是让有经验的电镜室老师帮你把关。否则自己 ...

还想问问你在制作TEM样品时，加了一滴exosome的PBS液体在铜网上5min之后，是直接就滴一滴磷钨酸还是等干了才滴加？我在加样品和磷钨酸的时候在铜网上都是一个水珠状。。5min中之后直接从旁边吸取多余的感觉能留在铜网上的很少了。。
作者: hzangs    时间: 2015-12-1 09:32
zjm337 发表于 2015-11-30 20:10
可不可以帮我看看我今天新拍的TEM。。。总觉得怪怪的呢。。谢谢！

可以
作者: zjm337    时间: 2015-12-1 10:36
hzangs 发表于 2015-12-1 09:32
可以

就在我这篇帖子的第一页。。我传到上面去了。。谢谢!
作者: hzangs    时间: 2015-12-1 15:44
看着还是不对……  你在哪里打电镜的？　　是上海的么？
作者: zjm337    时间: 2015-12-1 22:43
hzangs 发表于 2015-12-1 15:44
看着还是不对……  你在哪里打电镜的？　　是上海的么？

不是。。中南大学。。是不是我的FBS没有分离原有的exosome，对这个有影响？还是制样有问题？制样的时候我滴加样品在铜网上是水珠状的，5min之后用滤纸从旁边吸掉多余的，没有得到晾干，就滴加了磷钨酸（在铜网上也是成水珠状，没有散开），5min之后用滤纸吸掉多余的，然后用灯烘干。。。可是在拍TEM的时候铜网上像沾着一块一块黑的脏东西，不均匀，有一块好像还是可以飘动的。。我不知道是不是没有完全干造成的。。
作者: zjm337    时间: 2015-12-1 22:44
hzangs 发表于 2015-12-1 15:44
看着还是不对……  你在哪里打电镜的？　　是上海的么？

不是。。中南大学。。是不是我的FBS没有分离原有的exosome，对这个有影响？还是制样有问题？制样的时候我滴加样品在铜网上是水珠状的，5min之后用滤纸从旁边吸掉多余的，没有得到晾干，就滴加了磷钨酸（在铜网上也是成水珠状，没有散开），5min之后用滤纸吸掉多余的，然后用灯烘干。。。可是在拍TEM的时候铜网上像沾着一块一块黑的脏东西，不均匀，有一块好像还是可以飘动的。。我不知道是不是没有完全干造成的。。
作者: hzangs    时间: 2015-12-2 09:42
zjm337 发表于 2015-12-1 22:44
不是。。中南大学。。是不是我的FBS没有分离原有的exosome，对这个有影响？还是制样有问题？制样的时候我 ...

这个就不好说了。。。
因为我们的样品都是去掉了FBS里面的exosomes。 FBS里面的exosomes的含量还是很高的，应该是配夜里含量的一到两个数量级，不去除的话  影响非常大
作者: zjm337    时间: 2015-12-2 21:31
hzangs 发表于 2015-12-2 09:42
这个就不好说了。。。
因为我们的样品都是去掉了FBS里面的exosomes。 FBS里面的exosomes的含量还是很高的 ...

好的。。谢谢！我再重新来一遍看看。。
作者: zjm337    时间: 2015-12-21 22:30
本帖最后由 hzangs 于 2015-12-22 09:41 编辑
hzangs 发表于 2015-12-2 09:42
这个就不好说了。。。
因为我们的样品都是去掉了FBS里面的exosomes。 FBS里面的exosomes的含量还是很高的 ...

你好，这是我新拍的TEM，我感觉和你其他帖子里发的有些相似，你帮我分析分析是不是？？谢谢。。
作者: hzangs    时间: 2015-12-22 09:40
zjm337 发表于 2015-12-21 22:30
你好，这是我新拍的TEM，我感觉和你其他帖子里发的有些相似，你帮我分析分析是不是？？谢谢。。 ...

很不错。   你的电镜图可以上figure了
作者: 子非鱼    时间: 2015-12-23 14:23
hzangs 发表于 2015-12-22 09:40
很不错。   你的电镜图可以上figure了

咿咿...我怎么看不到新的图片....
作者: hzangs    时间: 2015-12-23 15:41
子非鱼 发表于 2015-12-23 14:23
咿咿...我怎么看不到新的图片....

他那天直接把自己拍的电镜原图发上来了，  为了避免被盗用，我把图删掉了。
作者: hzangs    时间: 2015-12-23 15:42
zjm337 发表于 2015-12-21 22:30
你好，这是我新拍的TEM，我感觉和你其他帖子里发的有些相似，你帮我分析分析是不是？？谢谢。。 ...

可以的话  请把你的电镜图打一下粗线，  之后发上来  给大家学习一下   谢谢
作者: zjm337    时间: 2015-12-24 08:50
子非鱼 发表于 2015-12-23 14:23
咿咿...我怎么看不到新的图片....

这是那天拍的TEM
作者: zjm337    时间: 2015-12-24 11:59
hzangs 发表于 2015-12-23 15:42
可以的话  请把你的电镜图打一下粗线，  之后发上来  给大家学习一下   谢谢 ...

请问一下，你买的抗体是在abcam上买的吗？价格好贵啊。。。你们买的货号还有吗？
作者: hzangs    时间: 2015-12-24 12:06
zjm337 发表于 2015-12-24 11:59
请问一下，你买的抗体是在abcam上买的吗？价格好贵啊。。。你们买的货号还有吗？ ...

ALIX 是CST的 货号：#2171
TSG101是abcam的 货号：# 5377-1
作者: zjm337    时间: 2015-12-24 15:37
hzangs 发表于 2015-12-24 12:06
ALIX 是CST的 货号：#2171
TSG101是abcam的 货号：# 5377-1

好的，谢谢！你没有检测CD63吗？
作者: hzangs    时间: 2015-12-24 16:06
zjm337 发表于 2015-12-24 15:37
好的，谢谢！你没有检测CD63吗？

没有去检测这个。  CD63 也是个marker   但是基本上杂两个marker 就可以说明问题了。 没有必要杂那么多
作者: 子非鱼    时间: 2015-12-25 17:18
hzangs 发表于 2015-12-23 15:41
他那天直接把自己拍的电镜原图发上来了，  为了避免被盗用，我把图删掉了。 ...

有道理，大神想得周到！
作者: 子非鱼    时间: 2015-12-25 17:20
hzangs 发表于 2015-12-24 16:06
没有去检测这个。  CD63 也是个marker   但是基本上杂两个marker 就可以说明问题了。 没有必要杂那么多 ...

这样啊，我买了三个，希望能出来至少2个，嘿嘿
作者: revive_0220    时间: 2015-12-26 20:20
请问一下你你是怎么离心的，我最后用10W g 2h 的沉淀物是淡黄色的，但是电镜的结果比你的好
作者: zjm337    时间: 2015-12-29 14:58
hzangs 发表于 2015-12-24 16:06
没有去检测这个。  CD63 也是个marker   但是基本上杂两个marker 就可以说明问题了。 没有必要杂那么多 ...

好的，谢谢！
作者: zjm337    时间: 2015-12-29 15:05
revive_0220 发表于 2015-12-26 20:20
请问一下你你是怎么离心的，我最后用10W g 2h 的沉淀物是淡黄色的，但是电镜的结果比你的好 ...

超速离心的方法，100ml 上清，300g 10min，2000g 10min，10000g 30min，100000g 70min 2次，再重悬到50微升PBS中
作者: revive_0220    时间: 2015-12-29 22:16
zjm337 发表于 2015-12-29 15:05
超速离心的方法，100ml 上清，300g 10min，2000g 10min，10000g 30min，100000g 70min 2次，再重悬到50微 ...

我最近的外泌体很难吹打溶解，吹打下来是一些碎片状的，感觉像有一些黏连物质，不知道你有出现这种状况不？
作者: zjm337    时间: 2016-1-9 20:51
revive_0220 发表于 2015-12-29 22:16
我最近的外泌体很难吹打溶解，吹打下来是一些碎片状的，感觉像有一些黏连物质，不知道你有出现这种状况不 ...

你提取exosome的培养基用之前离心过吗？多吹打几次应该可以吹打下来吧
作者: zjm337    时间: 2016-1-9 21:10
hzangs 发表于 2015-12-24 16:06
没有去检测这个。  CD63 也是个marker   但是基本上杂两个marker 就可以说明问题了。 没有必要杂那么多 ...

想问问你做WB的时候每个孔加的exosome蛋白浓度是多少？我180ml上清提取出来的蛋白浓度用BCA法检测出来特别低，每提取一次勉强能做一次WB。。总觉得自己方法有问题呢。。
作者: hzangs    时间: 2016-1-9 22:16
zjm337 发表于 2016-1-9 21:10
想问问你做WB的时候每个孔加的exosome蛋白浓度是多少？我180ml上清提取出来的蛋白浓度用BCA法检测出来特 ...

基本每个空 上两三微克
作者: 咏咩咩    时间: 2016-1-10 20:48
hzangs 发表于 2015-12-23 15:42
可以的话  请把你的电镜图打一下粗线，  之后发上来  给大家学习一下   谢谢 ...

请问做电镜的标本是直接用重悬的原液做的吗?还是要稀释了再做?
作者: hzangs    时间: 2016-1-11 09:50
咏咩咩 发表于 2016-1-10 20:48
请问做电镜的标本是直接用重悬的原液做的吗?还是要稀释了再做?

我是直接用重悬液做的。这个和你的exosome浓度有关。
作者: zjm337    时间: 2016-1-11 15:08
hzangs 发表于 2016-1-9 22:16
基本每个空 上两三微克

是每个孔的蛋白总量是两三微克，还是两三微克每微升？从细胞中提取的蛋白每孔加入的量和exosome的一样吗？我们实验室跑WB的时候每孔要加30微克蛋白，测出的每次从exosome中提取的没有这么多。。
作者: hzangs    时间: 2016-1-11 16:22
zjm337 发表于 2016-1-11 15:08
是每个孔的蛋白总量是两三微克，还是两三微克每微升？从细胞中提取的蛋白每孔加入的量和exosome的一样吗 ...

当然是每个孔 总共上两三微克  o(╯□╰)o   
作者: 咏咩咩    时间: 2016-1-12 17:42
hzangs 发表于 2016-1-11 09:50
我是直接用重悬液做的。这个和你的exosome浓度有关。

如果是1000倍稀释看nanosight有八次方。用原液看电镜可以吗？
作者: hzangs    时间: 2016-1-12 19:13
咏咩咩 发表于 2016-1-12 17:42
如果是1000倍稀释看nanosight有八次方。用原液看电镜可以吗？

这个 ，我不知道……
我当时没有用nanosight看。 直接测的蛋白浓度 大概 20ug左右吧
作者: 咏咩咩    时间: 2016-1-14 18:03
hzangs 发表于 2016-1-12 19:13
这个 ，我不知道……
我当时没有用nanosight看。 直接测的蛋白浓度 大概 20ug左右吧 ...

昨天用电镜看了~原液可以~
作者: 流氓兔2841    时间: 2016-1-15 09:52
zqy2002 发表于 2015-11-27 20:37
楼主上图中未见到明确的exosome；倒数第二张图中是背景色，不是exosome。描述的染色方法错误。磷钨酸负染请 ...

请问是哪个帖子？
作者: zjm337    时间: 2016-2-21 21:08
hzangs 发表于 2016-1-12 19:13
这个 ，我不知道……
我当时没有用nanosight看。 直接测的蛋白浓度 大概 20ug左右吧 ...

你好，想问问exosome测了蛋白浓度之后可以换算成摩尔浓度吗？我看的文献里好像都是直接用蛋白浓度表示exosome的量。。。但是我师姐建议我能换算成摩尔浓度更好，你有换算过吗？还是用nanosight先测出个数用个数来表达量？
作者: zjm337    时间: 2016-2-21 21:09
咏咩咩 发表于 2016-1-12 17:42
如果是1000倍稀释看nanosight有八次方。用原液看电镜可以吗？

请问一下你们的nanosight是用什么仪器？我们这边好像都没有这个仪器。。
作者: hzangs    时间: 2016-2-22 10:00
zjm337 发表于 2016-2-21 21:08
你好，想问问exosome测了蛋白浓度之后可以换算成摩尔浓度吗？我看的文献里好像都是直接用蛋白浓度表示exo ...

目前paper里面只有两种常见的反映exosomes量的方法，一种是用蛋白质的量反应exosomes的数量，一种是用仪器测定的粒子数目反映exosomes的量，还没有见过蛋白质 换算成exosomes摩尔浓度的方法。
作者: 咏咩咩    时间: 2016-2-22 14:11
zjm337 发表于 2016-2-21 21:09
请问一下你们的nanosight是用什么仪器？我们这边好像都没有这个仪器。。

马尔文的机器..NAT..名字就是nanosight..
作者: zjm337    时间: 2016-2-23 08:48
hzangs 发表于 2016-2-22 10:00
目前paper里面只有两种常见的反映exosomes量的方法，一种是用蛋白质的量反应exosomes的数量，一种是用仪 ...

好的，谢谢！我们这边没有nanosight仪器，表征的时候我不测exosome的粒子数可以吗？
作者: hzangs    时间: 2016-2-23 17:56
zjm337 发表于 2016-2-23 08:48
好的，谢谢！我们这边没有nanosight仪器，表征的时候我不测exosome的粒子数可以吗？ ...

做exosomes的鉴定和定性的时候  还是要有一个粒子数和粒子直径分布的数据的。
后面做实验 出表型  做机制的时候没有必要每次都测粒子数
作者: zjm337    时间: 2016-4-1 08:27
hzangs 发表于 2016-2-23 17:56
做exosomes的鉴定和定性的时候  还是要有一个粒子数和粒子直径分布的数据的。
后面做实验 出表型  做机制 ...

您好，问问您150~200ml上清大概能离心出多少微克蛋白的exosome？
作者: hzangs    时间: 2016-4-1 10:45
zjm337 发表于 2016-4-1 08:27
您好，问问您150~200ml上清大概能离心出多少微克蛋白的exosome？

我的细胞系 60-100ml  可以拿到约 20-40ug    不同的细胞系产量有差别。
作者: zjm337    时间: 2016-4-5 21:30
hzangs 发表于 2016-4-1 10:45
我的细胞系 60-100ml  可以拿到约 20-40ug    不同的细胞系产量有差别。

好的，谢谢！
作者: gjw423    时间: 2019-3-15 11:58
hzangs 发表于 2015-11-27 20:15
我们是将沉淀下来的exosomes 用少量的PBS 重悬，大概30ul。 然后10ul上样到铜网，沉淀1min，滤纸吸掉多余液 ...

请问你们用的示细胞上清吗，你们多少量的细胞上清用30ul的pbs重悬呀
作者: sante    时间: 2020-9-28 17:15
各位大神，我的电镜图打出来以后背景有很多条状杂质，不知道是什么东西，请问一下背景脏应该如何改进呢？我用的是超离的方法提取外泌体，超离前会用0.22um滤膜过滤一遍，100ml上清最后用100ulPBS重悬，没有稀释直接送样打电镜。不知道杂质是不是PBS里的盐或者什么?
作者: 898702935    时间: 2020-9-28 20:23
个人感觉SBI试剂盒提的外泌体，电镜结果不是特别好看。
用了一家国产公司的试剂盒，电镜结果还算可以。




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