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标题: 如何用维生素C和GAPDH讲述一个发在Science上的故事~ [打印本页]
作者: hzangs 时间: 2016-1-15 19:13
标题: 如何用维生素C和GAPDH讲述一个发在Science上的故事~
本帖最后由 hzangs 于 2016-1-15 19:14 编辑
如何用维生素C和GAPDH讲述一个发在Science上的故事
文/hzangs
随着基础研究的逐渐推进，几十年来人们对肿瘤的认识越来越深刻，随着肿瘤分子分型的发展，靶向药物正逐渐代替传统化疗药物成为肿瘤治疗过程中的首选。肿瘤药物靶点筛选和靶向药物寻找逐渐成为肿瘤学研究中的热门研究领域。
近期Science发表了有美国研究者Lewis C. Cantley等人的最新研究成果。他们发现高剂量维生素C（Vitamin C）在自发肿瘤鼠模型中可以特异性的杀伤KRAS/BRAF突变的结直肠癌细胞。临床统计表明，超过一半的结直肠癌患者携带有KRAS/BRAF突变。如果维生素C可以通过临床试验，那将是KRAS/BRAF突变型结直肠癌患者的福音。文章数据充实，结果可靠，无论从做科研的思路、实验设计安排，还是文章的表述上都很值得大家参考学习。
在本文里，hzangs将为大家解析这篇论文的行文思路，看看作者是如何用大家耳熟能详的维生素C和内参基因GAPDH讲述了一个充满希望的故事，并把故事写在了Science杂志上。
文章的开篇自然要先介绍背景。早在上世纪七十年代，两届诺贝尔奖得住Linus Pauling就和自己的同事在临床试验的基础上提出假设：维生素C可以延长肿瘤病人的生存期，对肿瘤有抑制作用。没错就是那个Linus Pauling，现在依旧生活在我们高中化学课本中的Linus Pauling，就是那个成功解释甲烷四面体结构，提出电负度、共振理论、价键理论、杂化轨道理论、蛋白质二级结构的科学界的“神人”。但是随后的大规模临床试验并没有得到支持这个假设的数据，自此开始，关于维生素C对肿瘤有没有抑制作用的争论开始了，旷日持久。 结直肠癌是一个发病率较高的肿瘤类型，并且是发病过程和机理研究相对比较透彻的一种癌症。在临床结直肠癌病人中，超过一半的病人写到有KRAS/BRAF基因突变。在之前的一些研究中发现，KRAS/BRAF基因突变会上调GLUT1表达。GLUT1是葡萄糖从胞外转运到胞内的重要转运体，同时GLUT1还在氧化态维生素C（即DHA）进入细胞的过程中作为转运体。
这使得作者想起之前针对维生素C对肿瘤有没有抑制效果的争论。
首先，作者需要考察的是KRAS/BRAF基因突变的肿瘤细胞是不是会通过高表达GLUT1而导致摄入大量的氧化态维生素C（DHA）。
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figure 1. KRAS/BRAF基因突变的结直肠癌细胞主要通过GLUT1摄取氧化态维生素C（DHA）。A.KRAS/BRAF突变的结直肠癌细胞会大量摄入氧化态维生素C，加入还原剂或者GLUT1抑制剂可以抑制其摄入。B.过表达GLUT1会提升氧化态维生素C吸收，敲除GLUT1则会抑制吸收。C.细胞内的维生素C也会随之变化。
可以确定KRAS/BRAF基因突变的肿瘤细胞会大量摄入DHA，那会对细胞的活力有影响吗？会杀伤肿瘤细胞吗？自发KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌老鼠模型上会有同样的效果吗？ 顺着这个思路，作者考察了DHA对KRAS/BRAF基因突变的肿瘤细胞的影响。
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figure 2. A. KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌细胞在大量DHA摄入时，细胞活性会降低。B.体内实验中，血液高水平维生素C对KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌瘤体大小有抑制作用。C.自发KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌小鼠模型中，维生素C同样会一直肿瘤的发生发展。D.E.自发型KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌小鼠同样会有GLUT1高表达和对DHA的高摄取。
现在发现，维生素C被大量摄取之后确实会对KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌具有抑制杀伤作用。所有的表型都已经拿到了，一个表型的阐释数据全都在这里了，现在要考虑的问题就是“维生素C是如何杀伤KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌的？”考虑到DHA在细胞内需要消耗细胞的还原剂（谷胱甘肽等）被还原成维生素C，而细胞内的还原剂（诸如谷胱甘肽、NADH等）主要用来防止氧化还原反应相关酶被活性氧破坏失活。考虑到这个问题，作者很自然开始考察高剂量DHA是不是抑制了细胞代谢，因此开始考察代谢过程。
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figure 3. 维生素C通过抑制糖酵解，降低细胞的ATP水平，选择性的杀伤KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌。A. KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌细胞在高剂量维生素C的作用下糖酵解过程中的中间产物出现积累，暗示糖酵解过程有相关酶受到抑制。B.C. KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌细胞内还原剂水平下降，ROS（活性氧）水平上升。D.糖酵解下游产物乳酸在KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌细胞中产量下降。E.F.ATP水平下降，AMP水平上升。G.H.还原剂或者糖酵解终端产物的加入可以恢复维生素C对KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌细胞的杀伤。
确定了高剂量维生素C会特异性的抑制KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌细胞的糖酵解过程。自然要寻找具体的抑制了那个酶，从而破坏了糖酵解过程。
从figure 3 A图中可以看到，在代谢途径中甘油醛-3-磷酸以上的糖酵解产物均有积累，而1,3-2磷酸甘油酸以后的产物水平均有下降。而GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）正是将前者转换成后者的重要酶。因此作者将重点放在了GAPDH上。
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figure 4. 维生素C介导的ROS抑制了GAPDH的活性，并且降低了NAD+ A. B. GAPDH活性位点被抑制型的检测抗体检测，KRAS/BRAF基因突变型结直肠癌细胞GAPDH被抑制。C.磷酸化的(ADP)r和磷酸化H2AX的上升表征ROS诱发的DNA损伤。说明NAD+被用于DNA修复造成，NAD+水平下降。而NAD+有时GAPDH酶促反应的辅基。D.抑制DNA损伤修复过程，有助于恢复细胞活性。
最后该文结束，一个 完整的故事就出现在了大家面前。总结一下全文，作者发现KRAS或者BRAF突变的结直肠癌细胞会高表达GLUT1，同时葡萄糖的代谢偏向于通过非氧化型磷酸戊糖途径和糖酵解以适应高速的代谢和细胞增殖。而GLUT1对氧化型维生素C（即DHA）具有转运作用，可将胞外的DHA转运至胞内。KRAS/BRAF突变的结直肠癌由于GLUT1的高表达造成了DHA的大量摄取，大量进入胞内的DHA又会消耗胞内的还原剂（编者注：谷胱甘肽等还原性分子，通常用来保护细胞中氧化还原反应相关酶类不被氧化破坏），胞内还原剂的下降造成了氧化还原相关酶（本文中主要是GAPDH）的氧化损伤和ROS（活性氧，reactive oxygen species）水平的上升，ROS诱发的DNA损伤进一步消耗NAD+等代谢辅基，抑制糖代谢产能过程，两方面共同作用引起肿瘤细胞内代谢障碍，能量（ATP）水平下降，诱发肿瘤细胞凋亡。KRAS/BRAF突变的结直肠癌细胞或正常细胞由于胞内相对较高的还原剂水平和较为正常的GLUT1的表达水平，对高浓度维生素C并无明显反应。
该研究发现同时说明维生素C可能会是一个针对KRAS/BRAF突变结直肠癌的靶向药物，当然这还需要进一步的大样本量的临床试验验证。高剂量的血液维生素C浓度对人体几乎没有太多副作用，如果维生素C可以成为一个全新的肿瘤靶向药物，那将是KRAS/BRAF突变型结直肠癌病人的福音。让我们拭目以待吧。
作者: hereissyk 时间: 2016-1-16 15:02
KRAS/BRAF基因突变的肿瘤细胞的构建有人会吗？
作者: hzangs 时间: 2016-1-17 13:40
看怎么构建了。
KRAS G12D的突变体质粒 很easy，KRAS突变诱发一个永生化细胞系癌化 也不难。 比较难的是制作KRAS G12D 条件突变型的老鼠~
作者: hereissyk 时间: 2016-1-17 20:11
跟了一下文献，他们团队09年的文章里面有具体方法。
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