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标题: Life试剂盒提外泌体的一些疑问 [打印本页]
作者: xuxu    时间: 2014-12-7 21:18
标题: Life试剂盒提外泌体的一些疑问
本人最近用Life的试剂盒提细胞培养基内的exosome，离心后看不到任何沉淀，因为试剂盒说明书上也有写，多数情况下是看不到沉淀的，所以继续做了WB，但是用WB检测Alix的时候完全看不到条带，想请教下各位大神有没有遇到过这种情况，是我用的培养基太少了，还是有其他细节我没有注意到。谢谢！

作者: ffp1988    时间: 2014-12-8 08:21
我也用过life的试剂盒，就是测不到蛋白的浓度？一直也很困惑
作者: 王帅帅    时间: 2014-12-8 12:29
我最近也用life的盒子，按说明书要求提取后也是没有沉淀，做考染也没有条带（10ml上清），分析可能是样品量太少了，因为我用100000g离心过的血清培养细胞三天后收上清，提取后可以看到沉淀，考染也能染出来。
作者: fjzmx    时间: 2014-12-8 20:11
我最近用Life试剂盒提取1ml血浆外泌体，得到的沉淀，吹不散，很奇怪，像脂质体一样的东西，求解
作者: xuxu    时间: 2014-12-9 19:46
Johnny 发表于 2014-12-8 11:48
我觉得是细胞上清量太少了，做WB的话，我觉着至少要能看到exosome沉淀，如果看不到沉淀 说明exosome量太少 ...

恩，明天准备多用些细胞上清再提一次试试
作者: xuxu    时间: 2014-12-9 19:50
王帅帅 发表于 2014-12-8 12:29
我最近也用life的盒子，按说明书要求提取后也是没有沉淀，做考染也没有条带（10ml上清），分析可能是样品量 ...

我用的是14ml的上清，没看到沉淀。你是提了多少上清才看到沉淀的？是用试剂盒提的么？我觉得取上清的量应该和细胞类型也有关系吧，有些细胞分泌Exosome比较多，很少量的上清就可以提出Exosome，我看坛子里有人用2ml的上清就可以提出很多Exosome
作者: xuxu    时间: 2014-12-9 19:56
fjzmx 发表于 2014-12-8 20:11
我最近用Life试剂盒提取1ml血浆外泌体，得到的沉淀，吹不散，很奇怪，像脂质体一样的东西，求解 ...

我也不知道啊...
作者: 王帅帅    时间: 2014-12-10 16:08
life盒子的说明书里边说 ，如果你要是能够制备FBS消耗的培养基，就可以用这用培养基养细胞，然后按试剂盒的说明沉淀EXO，我第一次做的时候用的是FBS，100000g过夜离心后的血清，培养细胞，三天后收集上清，8ml，就可以看到白色沉淀，考染也有条带。最近换成试剂盒的另一种办法细胞培养24h后，换成DMEM，连续12h后收集20ml上清后没有发现沉淀，考染也没有条带，昨天我问公司的技术，他们的回答是可能是细胞上清量不够，不同细胞分泌EXO的能力是不同的，另外一个就是如果用FBS消耗的血清培养细胞可以得到EXO的话，也是可以的。不放心的话可以做一个FBS消耗的对照。我自己分析也是这样，细胞只加DMEM12个小时，和细胞用FBS消耗血清培养3天，EXO的分泌量可定是不一样的。具体还有待验证。
作者: 王帅帅    时间: 2014-12-10 16:23
大家有谁做过三氯乙酸沉淀蛋白？我用碘克沙醇密度梯度离心后，收集梯度分数，TCA／丙酮沉淀蛋白，用20%TCA（丙酮溶解），-20度沉淀90分钟，15000g离心30min，然后丙酮洗三次，每次15000g 30min ,步骤完成后可以看到白色沉淀，然后2%SDS+pmsf溶解，5×buffer，95℃ 5min ,12%分离胶，最后做银染可是什么条带都没有。有经验的能不能给与指导？在一个问题，我用碘克沙醇梯度离心后，从顶部分层抽取梯度，可是测量密度的时候（分析天平）有变化的趋势，但是相邻的几个密度变化不大，而且还有出现随着梯度增加密度减少的情况。不知道有什么解决办法。这是我实验遇到的问题。希望大家能够相互讨论一下。
作者: xuxu    时间: 2014-12-12 10:23
王帅帅 发表于 2014-12-10 16:08
life盒子的说明书里边说 ，如果你要是能够制备FBS消耗的培养基，就可以用这用培养基养细胞，然后按试剂盒的 ...

能不能加无血清的培养基时间长一些，比如24或48小时，或者更长时间，这样可能细胞分泌的EXO会多一些，但是又怕对细胞活力有影响...
作者: 王帅帅    时间: 2014-12-12 19:54
具体的你可以跟公司联系一下，我觉得用消耗掉EXO的血清养细胞然后收集上清，是一个比较省事的方法，前提是必须作对照，这样不就好了 ？要不然你可以试试这样行不行。
作者: rubisco    时间: 2015-1-18 22:35
Life的试剂太贵，因此我用1mlHepG2细胞培养上清提取的exosome，10000g离心后能看到沉淀，不知道是不是exosome。。。。
作者: yanan228    时间: 2016-5-17 15:46
xuxu 发表于 2014-12-12 10:23
能不能加无血清的培养基时间长一些，比如24或48小时，或者更长时间，这样可能细胞分泌的EXO会多一些，但 ...

可以的，我用的是MCF-7细胞无血清DMEM培养48h，没问题的



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