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标题: 超离提取的exosome WB鉴定 [打印本页]

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作者: ffp1988    时间: 2014-12-9 10:14
标题: 超离提取的exosome WB鉴定
如何提取蛋白和跑WB才能出来满意的条带？？？？？？？？？？？？？？？？？

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作者: 王帅帅    时间: 2014-12-9 10:38


无论用什么方法，获得的EXO的量的多少是很重要的 ，推荐做好用试剂盒，你用超速离心法查宿分离的话，不仅浪费时间，而且也浪费金钱，一个超高速离心管的价钱是多少？贝克曼的我不知道，但是日立的大概算下来一个50快，而且离心管的使用是由寿命的，在一个就是你用差速离心得用多少上清液，多少血清，培养基，这些算下来不如一个试剂盒合算。











ps：我是hzangs， 在这里只好通过编辑楼层来回复层主的言论了。    这里随便更改了层主的帖子，还望见谅。
目前看，很多PEG-base沉淀分离法试剂盒在分离外泌体方面存在非常大的缺陷，一个明显的表征就是 沉淀下来的所谓的“外泌体” 蛋白量非常大，一般比超离分离法高出1个甚至几个数量级。 这样的结果很可能是由于在沉淀的时候 大量的杂蛋白被沉淀下来了。 这些所谓的外泌体样品中 可能外泌体所占的比例 微乎其微。目前只有少数一两款是其他原理的kit，主流的一些试剂盒包括life、SBI等等大部分是PEG-base的。 使用PEG-base的沉淀试剂盒进行试验，在投paper的时候很容易受到reviewer的质疑，论坛里已经有朋友遇到这样的问题了。 所以在这里给大家提个醒。 超离是目前的金标准，这个毋庸置疑，有时间有条件的研究者 还是老老实实的考虑使用超速离心吧，没条件没时间的 可以考虑尝试一下其他的方法。千万不要图一时的省事而带来后期的隐患

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作者: 惜名    时间: 2014-12-16 21:02
的确如楼上所说，足够的量很重要。另外，抗体的选择也极为重要，用过几次abcam的，感觉效果极佳。而且abcam在中国设了库，大部分抗体的到货时间只需要几天，赞~

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作者: Aoterdong    时间: 2014-12-19 16:25

惜名 发表于 2014-12-16 21:02
的确如楼上所说，足够的量很重要。另外，抗体的选择也极为重要，用过几次abcam的，感觉效果极佳。而且abcam ...

请问你有没有比较详细的跑WB的步骤，可以交流一下吗？

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作者: 王帅帅    时间: 2014-12-20 12:27
AB的抗体我问了，好像CD63没有现货，所以我选用了santa的cd63抗体，Alix选择的就是santa的抗体，做出来还不错，但是cd63现在还在做，个人觉得CD63应该好做，我用差速离心的方法提取的EXO，选用博奥森的cd63抗体都能做出来，只不过为了使结果更有说服力，选用了santa的抗体。

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作者: 王帅帅    时间: 2014-12-20 12:31
顺便问一下 有没有人做过密度梯度离心呢？我选用的是线性碘克沙醇梯度，目的是通过沉降速率离心分离EXO和病毒，从而研究病毒感染和EXO的关系，但是这个密度梯度好像和不好做，我选用两室梯度杯，梯度混合器，蠕动泵，但是做出来的梯度不理想，不知道有没有用这个方法做过线性梯度的。

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作者: xuemei7868650    时间: 2015-2-13 17:48
同求exosome蛋白的提取方法

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作者: luckkit    时间: 2015-3-10 13:40

xuemei7868650 发表于 2015-2-13 17:48
同求exosome蛋白的提取方法

就是买试剂盒分离Exosomes,如果想进一步MS鉴定的话，就跑2D

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作者: luckkit    时间: 2015-4-10 13:31
转来的，
https://www.researchgate.net/pos ... nvolving_exosomes/1
Ketil winther Pedersen · 31.11  · 59.54  · ThermoFischer Scientific,


Hi Sami, I would just like to share some thoughts with you after working with exosomes and downstream western blotting for a while. It is my experience that there are many factors that are important for WB detection. First, its the source from where the exosomes are derived from. It seems that different host cells release different amounts of exosomes into the surrounding environment. If cell lines are the source - for how long the cell culture has been "running" (# of splits) might have an impact on the amount of exosome released. Then it is the enrichment step. How is the exosomes enriched? Ulracentrifugation? Precipitation? I did spend a lot of time optimizing the amounts of exosomes used and also dilutions used and also lysis conditions (happy to share that with you. just send me an email to ketil.pedersen@lifetech.com). Then, its the blotting part of the workflow. How is the proteins blotted to the PVDF membranes? wet blotting? Finally, its the labeling. Have you tested whether you are able to detect the classical tetraspanin proteins such as CD63 or CD81. If the exosomes should express these proteins it could be a way to verify that exosomes are in your enriched sample (alternatively you might consider analyzing the enriched exosome prep by negative stain electron microscopy just to verify the presence of exosomes). Labeling for CD63/CD81 usually require non-reducing conditions as Dr. Ana mentioned above. In terms of exposing the bands my experience is that chemiluminescence is required to visualize the target bands.

good luck
Ketil Winther Pedersen

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作者: meme    时间: 2015-10-20 16:31

Aoterdong 发表于 2014-12-19 16:25
请问你有没有比较详细的跑WB的步骤，可以交流一下吗？

大神有没有可以共享的WB的步骤？

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作者: hzangs    时间: 2015-10-20 19:55

王帅帅 发表于 2014-12-9 10:38
无论用什么方法，获得的EXO的量的多少是很重要的 ，推荐做好用试剂盒，你用超速离心法查宿分离的话，不仅浪 ...

不要轻易选一些沉淀型的试剂盒。  不然等到reviewer 质疑你的时候  你就傻眼了。。。  你可以问问惜名的遭遇。。。。

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作者: zjm337    时间: 2016-1-11 15:20

王帅帅 发表于 2014-12-20 12:27
AB的抗体我问了，好像CD63没有现货，所以我选用了santa的cd63抗体，Alix选择的就是santa的抗体，做出来还不 ...

你好，想问问你做WB的时候每孔加的蛋白总量是多少？

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作者: wjy    时间: 2016-1-12 10:51

王帅帅 发表于 2014-12-20 12:31
顺便问一下 有没有人做过密度梯度离心呢？我选用的是线性碘克沙醇梯度，目的是通过沉降速率离心分离EXO和病 ...

你的碘克沙醇的密度梯度结果怎么样？我也是做病毒和exo分离，我采取的是蔗糖垫来分，刚开始做，还不知道结果如何。

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作者: wjy    时间: 2016-1-19 14:01

惜名 发表于 2014-12-16 21:02
的确如楼上所说，足够的量很重要。另外，抗体的选择也极为重要，用过几次abcam的，感觉效果极佳。而且abcam ...

看到帖子，求问一下，足够的量是指多少呀？给个建议，你一般都多大的量做一次wb

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作者: 惜名    时间: 2016-1-20 14:16

wjy 发表于 2016-1-19 14:01
看到帖子，求问一下，足够的量是指多少呀？给个建议，你一般都多大的量做一次wb ...

外泌体蛋白如果纯度很高(譬如用超离提)，3-5ug即可跑一次WB了
我用试剂盒做，一般也是加5-10ug。

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作者: wjy    时间: 2016-1-21 10:32
那你在多少细胞上清液中提取的exo那？

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作者: wangjoseph    时间: 2016-1-21 15:08
不同的细胞系分泌量不同，
不同的抗体灵敏度也不同，
个人认为别人的结果只能参考，
就本人的几个细胞系和几个抗体来看，
10万个细胞的量就可以了。

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作者: binbinpolite    时间: 2016-4-22 15:35

hzangs 发表于 2015-10-20 19:55
不要轻易选一些沉淀型的试剂盒。  不然等到reviewer 质疑你的时候  你就傻眼了。。。  你可以问问惜名的 ...

英雄所见略同啊  看大家的回复 各种关心量  文献中早就报道试剂盒提取的exo不纯   容易受到质疑

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作者: 君扬2009    时间: 2016-10-19 21:34
学习了  看来还是超速离心最靠谱

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作者: sonja_forever    时间: 2016-12-13 10:39

惜名 发表于 2016-1-20 14:16
外泌体蛋白如果纯度很高(譬如用超离提)，3-5ug即可跑一次WB了
我用试剂盒做，一般也是加5-10ug。 ...

请问外泌体上样5-10ug，是不是对应的用来做对照的细胞系也上样5-10ug呀？

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作者: 惜名    时间: 2016-12-24 20:19

sonja_forever 发表于 2016-12-13 10:39
请问外泌体上样5-10ug，是不是对应的用来做对照的细胞系也上样5-10ug呀？

不是，细胞lysis应该上多一点~

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作者: shenxiameng10    时间: 2017-4-17 16:47

王帅帅 发表于 2014-12-20 12:27
AB的抗体我问了，好像CD63没有现货，所以我选用了santa的cd63抗体，Alix选择的就是santa的抗体，做出来还不 ...

想请问下，你差速离心后外泌体蛋白量达到多少时WB可以显出条带？？

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作者: shenxiameng10    时间: 2017-4-17 16:51

惜名 发表于 2016-12-24 20:19
不是，细胞lysis应该上多一点~

从250ml细胞上清中提出的外泌体，20ul重悬，上样蛋白量达到20ug，为什么跑阳性抗体时候，不仅跑不出来，反而细胞中有呢？？

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作者: 八戒在五湖    时间: 2017-6-19 11:54

惜名 发表于 2014-12-16 21:02
的确如楼上所说，足够的量很重要。另外，抗体的选择也极为重要，用过几次abcam的，感觉效果极佳。而且abcam ...

你好，能问一下你用的abcom的抗体货号吗

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