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标题: 【sci rep】一百块钱的材料自己制作总价十几万的SBI试剂盒 [打印本页]
作者: hzangs 时间: 2016-4-15 23:12
标题: 【sci rep】一百块钱的材料自己制作总价十几万的SBI试剂盒
本帖最后由 hzangs 于 2017-8-17 11:06 编辑
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论文原文在本帖二楼。
读完这篇文章，你可以用一百块钱的材料自己制作总价值十几万的SBI沉淀试剂盒
相信大家一直很纠结于外泌体的分离纯化。超速离心一轮复一轮，简直是在磨灭青春；沉淀试剂盒几十毫升动辄报价几千甚至上万，看着就让人肉疼，用着简直心如刀绞啊，主要成分为PEG等高聚物的溶液加个包装成本不过十几块钱却要卖到几千块，实在让人无奈啊。现在你不需要再纠结了，4月12日发表的sci rep上的一篇方法学文章为大家带来了曙光。来自佛罗里达州立大学的研究者为大家解析了PEG聚沉法分离外泌体的关键步骤，并且优化了一整套分离方法。
PEG聚沉在过去的几十年里一直是富集病毒的经典方法，而外泌体的大小和部分理化性质又与病毒及其相似，这也就是的PEG聚沉分离外泌体成为了可能，在外泌体研究突飞猛进的这两三年里，一些公司也开发了依据高分子聚合物聚沉原理的沉淀试剂盒，但是售价却高的惊人。笔者相信，近期发表的这篇文章将会大大降低大家使用沉淀法的成本。
文章摘要：细胞分泌的胞外囊泡，例如外泌体，最初被认为是细胞用来排除胞内废物的方式，现在被公认在多种健康或者疾病过程中发挥作用。虽然外泌体在体液中大量存在，但是由于其理化特性，纯化外泌体还是面临着诸多困难。近段时间来，容易操作的商业化试剂盒被很多人用于分离外泌体，但由于其低纯度和高污染量一直制约着它们的推广和应用。本文中，我们介绍了一种纯化外泌体和其他胞外囊泡的方法，该方法由过去利用聚乙二醇富集病毒的方法发展而来。这个技术被我们称为—ExtraPEG，该方法可以从大体积的培养液中通过低速离心配合小体积的超速离心纯化从而快速和廉价的富集外泌体。该方法富集的外泌体可以用于后续的外泌体定量以及蛋白和RNA的定量分析，蛋白组学和测序分析，这也证明该方法可以用于生物标志物的开发和未来诊断应用中。同时，进一步的实验证明该方法分离得到的囊泡的生物活性并未受到影响。ExtraPEG方法通过简易改变即可适用于不同囊泡组分的富集，也可以也用来作为进一步纯化前的高效浓缩过程。这一方法可适用于多种多样的体液中囊泡的分离，分离得到的囊泡可用于各种各样的后续研究。
电镜图：[attach]522[/attach]
可见，8%PEG联合小体系超离纯化即可获得非常漂亮的电竞图片。
粒子浓度和粒径分布分析：[attach]523[/attach]
可以看到媲美蔗糖垫超速离心的粒子浓度和粒径分布。
下面笔者将解析一下作者提供的试剂配方和实验方法：
Polyethyleneglycol with Mn (number average molecular weight) of 6000 (Sigma, 81260)wascombined with filtered water (18.3 Mega-ohm system; ELGA Purelab flexpurification system) and sodiumchloride (1 M) to make a two-fold concentrated(2x) stock solution.
适量聚乙二醇（Mn平均分子质量=6000）溶解于纯水中同时加入氯化钠，使氯化钠浓度为1M。从而得到2倍浓度的储存液。
（编者注：将16g聚乙二醇溶解于水中，在加入5.844g氯化钠，定容至100ml即为储存液。使用时，1ml培液加入1ml上述储存液即可）
Vesicle-containingmedium from cell culture
was centrifuged at500 g for five minutes followed by 2,000 g for thirty minutes at 4 °C to removecellular
debris and largeapoptotic bodies. Once centrifuged, the media was added to an equal volume of a2. PEG solution
at 4 °C, toachieve a desired final PEG concentration (5–15%). After the 2. PEG solutionwas added, samples
were mixedthoroughly by inversion, and incubated at 4 °C overnight (at least 12 hrs). Thenext day, samples were
centrifuged in atabletop centrifuge at maximum speed (Eppendorf, model 5810 R using an S-4-104swing bucket
rotor; 3,214 g)for 1 hour at 4 °C. Conical tubes were then decanted, and allowed to drain forfive minutes, tapping
occasionally toremove excess PEG. The resulting pellet was suspended in 50–500 μL ofparticle-free PBS (pH 7.4).
Subsets of sampleswere then either stored at − 80, or further purified by PEG-precipitation for a secondtime
using a lowerconcentration of PEG, or by re-suspending in PBS and centrifuging at 100,000 gto wash and
re-pellet thevesicles. For the former group of samples, the pellet resulting from theprimary PEG treatment was
diluted in 5 mLPBS. An equal volume of 2. PEG solution was added, this time to a lower finalPEG concentration
of 5%. The lattersamples were suspended in 1 mL PBS and ultracentrifuged (100,000 g) for 70minutes to wash the
particles ofcontaminating protein and PEG. All samples were finally resuspended inparticle-free PBS, by shaking
at roomtemperature for up to 30 minutes.
编者适当解释上述英文不再做翻译。500g和2000g离心去掉细胞碎片。加入1倍体积上述PEG溶液，4°过夜孵育。常规离心机最高转速1h后收集沉淀。沉淀重悬与PBS，使用略低浓度PEG再次聚沉或通过小体系超速离心纯化外泌体。
到此结束，文章解析了PEG聚沉分离外泌体的方法。笔者做了一个粗略的计算，如果使用国产的生工出品PEG6000，生工官网报价为500g/76元。大约可以配置16%PEG溶液3125mL。相当于62.5瓶50mL装Life沉淀试剂盒，12.5瓶50mL SBI沉淀试剂盒。而即使使用文章作者建议的sigma的PEG6000 官网价格也仅需要1kg/756.99元。 沉淀法分离外泌体从此不再是试剂盒的天下！使用沉淀法的朋友们也可以告别割肉的时代，开启一个新纪元。
文献全文见论坛相关帖。
沉淀试剂盒相关专利书请见：http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect1=PTO2&Sect2=HITOFF&p=1&u=%2Fnetahtml%2FPTO%2Fsearch-bool.html&r=1&f=G&l=50&co1=AND&d=PTXT&s1=%22US+9,005,888+B2%22&OS=
作者: hzangs 时间: 2016-4-17 12:39
本帖最后由 hzangs 于 2016-5-26 21:04 编辑
文献全文
作者: 胖子的心境 时间: 2016-4-17 13:08
这个分享只能说没有谁了！里面说的最大转速离心，大概要达到多少转速啊？不用水平转子得行不呢？
作者: hzangs 时间: 2016-4-17 13:40
如果你使用两次PEG沉淀离心。 基本就是高速离心机 10000G左右即可
我最近准备尝试用这个方法试一下。 如果可以 回头我会写一下我的一些心得和步骤
作者: Bridgen桥生物 时间: 2016-4-17 14:08
一直关注着，等待楼主的实验结果，嘿嘿
如此无私的贡献自己所知道的，真的很值得敬佩和学习。
作者: hzangs 时间: 2016-4-17 14:57
您过奖了。 谢谢
作者: wjy 时间: 2016-4-18 16:21
hzangs 太赞啦，棒棒哒
作者: hzangs 时间: 2016-4-18 16:29
作者: zhang1xin 时间: 2016-4-18 17:26
顶起！！
作者: seallin 时间: 2016-4-18 20:01
这篇文章做的很系统，我做的方法与该方法很类似，可惜，比我早发表了
作者: hzangs 时间: 2016-4-18 20:13
不要气馁。 至少说明这条路是走得通的。 如果你能够通过PEG沉淀得到非常纯的exosome 也会是一个比较好的protocol。 毕竟 这篇paper秀电镜图的时候 还是PEG+超离的结果。 加油吧
作者: seallin 时间: 2016-4-18 20:42
谢谢，我的论文已经大修后投稿了，与这篇文章基本差不多，不过侧重点不一样，我主要是侧重蛋白质组方向的分析，由于前段时间补生物学重现性的数据补的很头疼，所以耽搁了好几个月。谢谢支持！
作者: c1c2c3c45678 时间: 2016-4-20 15:48
大神，买的是生工产的吗
作者: hzangs 时间: 2016-4-20 16:02
是的。 我要先试试效果如何。
作者: c1c2c3c45678 时间: 2016-4-20 16:46
哦哦，我也订了，等待送货，不知道效果会怎么样
作者: hzangs 时间: 2016-4-20 17:08
我的到货了。 今天会开始尝试。 然后后面 染一下Ponc.S. 和 exosomes marker~~ 有结果了 分享给大家
作者: hzangs 时间: 2016-4-20 17:08
我的到货了。 今天会开始尝试。 然后后面 染一下Ponc.S. 和 exosomes marker~~ 有结果了 分享给大家
作者: zyjjxb 时间: 2016-4-20 22:17
这个适用于血清吗？还是只适用于细胞培养液？大神解惑一下
作者: hzangs 时间: 2016-4-20 22:21
文章中有介绍。作者使用8%PEG沉淀+超速离心清洗 的方法， 从血清里拿到了外泌体，跟超速比较 结果还不错。
个人感觉，这个paper的最大的优点就在于 可以让超速离心的步骤少一点。 由于我还没有尝试，待尝试完了 再分享给大家数据。 血清的我可能没办法做，没有那么多样本 o(╯□╰)o
作者: c1c2c3c45678 时间: 2016-4-22 10:21
呃，Ponc.S这个是什么啊
作者: hzangs 时间: 2016-4-22 10:26
丽春红染色
作者: yulia 时间: 2016-5-10 07:47
大神，你做了吗？提取的怎么样，求分享！！
作者: hzangs 时间: 2016-5-10 10:45
http://www.exosome.com.cn/forum. ... &page=6#pid5396 数据在这 哈哈
作者: yzyhans 时间: 2016-5-28 15:05
最近准备做，关注一下
作者: xhn890 时间: 2016-5-30 16:05
多谢楼主。正在做这方面的实验。很宝贵。
作者: pytruth 时间: 2016-5-31 16:11
顶起！！
作者: elvisun 时间: 2016-5-31 21:36
hzangs 发表于 2016-4-17 12:39
**** 本内容被作者隐藏 ****
文献全文
文章威武，楼主雄壮
作者: shjdsxx 时间: 2016-6-1 14:24
有没有原文
作者: divebomb 时间: 2016-6-2 17:13
多谢楼主
作者: 86964109 时间: 2016-6-3 13:56
感谢分享
作者: hereissyk 时间: 2016-6-4 16:59
4000g离心一小时管子居然裂了。。。
作者: hzangs 时间: 2016-6-5 20:16
我去…… 亲 你运气怎么那么差呢。。。
作者: hereissyk 时间: 2016-6-5 22:42
没被管理员发现算运气好~
作者: hzangs 时间: 2016-6-6 09:36
作者: Bridgen桥生物 时间: 2016-6-6 13:24
啥质量的管子呀，这么差
作者: 圣裤裤 时间: 2016-6-7 01:27
最近想做呢，看到这个方法真帮大忙了
作者: liuwf0716 时间: 2016-6-12 22:05
速度啊，果然厉害！
作者: zestyhuan 时间: 2016-6-14 14:52
非常好的文章
作者: 张宏道 时间: 2016-6-16 16:28
不错不错
作者: bluesat 时间: 2016-6-17 13:18
hzangs谢谢你的付出，关注着，等待楼主的实验结果！
作者: sldingxiang 时间: 2016-6-18 15:41
谢谢楼主分享
作者: ilsyvm 时间: 2016-6-22 09:04
拜读此文章
作者: denisqiang 时间: 2016-6-22 19:09
看看全文
作者: 轻舞肥羊羊 时间: 2016-6-23 09:32
求全文，谢谢啦
作者: jianwen 时间: 2016-6-24 16:29
看看先，谢谢
作者: lllcccyyyy 时间: 2016-6-27 11:33
求文献全文
作者: min2009 时间: 2016-7-7 09:33
很好的东西，哈哈，赞
作者: hanjs7013 时间: 2016-7-10 14:29
就是这个文章，很实用，很不错！
作者: lzjmei 时间: 2016-7-19 10:42
谢谢楼主分享！
作者: zwmiao 时间: 2016-7-21 18:49
谢谢楼主分享
作者: FunkyWoody 时间: 2016-7-28 17:05
碉堡了！！
作者: nene 时间: 2016-7-30 16:34
楼主，请问您有没有验证这个方法啊？好期待啊
作者: hzangs 时间: 2016-7-30 19:12
有验证过。http://www.exosome.com.cn/forum. ... amp;_dsign=1013073e
作者: 正经的保洁小弟 时间: 2016-8-3 13:44
没钱可以试试
作者: vipivy 时间: 2016-8-4 22:28
十分感谢分享
作者: dolphinwelkey 时间: 2016-8-6 08:12
想看看原文啊
作者: nene 时间: 2016-8-10 17:59
楼主真好！
作者: exolin 时间: 2016-8-17 16:17
学习学习
作者: xiongbo2010 时间: 2016-8-19 21:53
好文章，一直烦恼外泌体的抽提问题，，，
作者: xphiles 时间: 2016-8-20 00:31
什么叫超牛，这就是
作者: yidingxing 时间: 2016-8-20 10:20
感谢分享！
作者: 微泡biomarker 时间: 2016-8-21 16:41
赞一个，楼主辛苦啦
作者: dtzy1157 时间: 2016-8-23 18:16
学习一下，刚好才开始进行，还在考虑买不买thermo的试剂盒呢
作者: littleanchor 时间: 2016-8-24 17:56
谢谢分享
作者: Katherinedata 时间: 2016-8-31 10:32
谢谢大神分享
作者: zouxue1985 时间: 2016-9-5 14:55
楼主太厉害
作者: zhesuk 时间: 2016-9-5 15:16
辛苦楼主
作者: littleangelpig 时间: 2016-9-6 10:47
胞外体分离提纯是耗费心力的大难点，这个方法如果提取和纯化鉴定后的胞外体可行的话，善莫大焉！
作者: qschenpeng 时间: 2016-9-27 16:24
感谢分享
作者: kevincatalyst 时间: 2016-10-2 20:31
点赞！这种文章简直是我们这些穷苦百姓的救星啊
作者: amyisbest 时间: 2016-10-6 10:31
学习下
作者: 溪澈冰清 时间: 2016-10-11 17:17
感谢！！学习阶段，拜读一下
作者: 叶香辰 时间: 2016-10-11 18:11
感谢分享
作者: ashey 时间: 2016-10-14 09:00
跟随大神的脚步！
作者: huanxile 时间: 2016-11-5 14:43
好文章啊，谢谢啊
作者: angelocream 时间: 2016-11-14 09:27
求看求看
作者: dongyolo 时间: 2016-11-14 14:26
求文献全文
作者: konggy 时间: 2016-11-14 15:10
楼主这种方法使用的结果如何，能否给我们分享一下。
作者: allen123 时间: 2016-11-17 11:46
学习学习
作者: exosome0921 时间: 2016-11-17 15:02
顶！外泌体新手来取经了！
作者: 菜鸟吴 时间: 2016-11-18 02:21
感谢楼主
作者: tripitaker 时间: 2016-11-19 19:47
谢谢楼主！
作者: GJ609 时间: 2016-12-9 16:48
太棒啦，最近打算做外泌体，一直在差速离心和各个公司的试剂盒中比较，纠结着
作者: AIR2000 时间: 2016-12-12 16:31
求文献全文
作者: nye707 时间: 2016-12-13 15:03
学习了学习了学习了学习了
作者: dantuying 时间: 2016-12-14 13:45
文献全文
作者: lnc08med 时间: 2016-12-16 23:46
赞一个！
作者: qfriday 时间: 2016-12-27 20:53
高手，学习了
作者: alexander 时间: 2017-1-13 05:24
謝謝分享樓主辛苦
作者: dawnzhao 时间: 2017-1-18 10:29
感谢楼主，收获很大，谢谢
作者: dawnzhao 时间: 2017-1-18 11:27
楼主感谢您的精彩分享，感激不尽，您有试过8%PEG+5%PEG这种方法吗？因为没有超速离心，所以想试试这种方法如何，之前都是用SBI试剂做的，确实杂质很多啊，谢谢啊。
作者: jlj1917576238 时间: 2017-1-18 13:28
点赞,点赞 。。。。。。
作者: shililistone 时间: 2017-1-23 09:56
非常有帮助，求原文链接
作者: rslkd 时间: 2017-2-11 10:50
学习一下！
作者: kao3234659 时间: 2017-2-12 03:44
不得不说PEG 沉淀方法分泌出来的EVs的污染很大！
作者: kao3234659 时间: 2017-2-12 03:50
PEG 沉淀出来的是保外囊泡，不能交外泌体，沉淀出来的pellet还是需要进一步分离才能分离出外泌体，还有PEG 沉淀的局限性很大，对于细胞培养液这种方法还行，对于蛋白含量太高的杨平，如血清，效果就不行了。
作者: xcf201314 时间: 2017-2-13 13:49
感谢分享
作者: dangerous517 时间: 2017-3-21 22:26
好人平安
作者: esound 时间: 2017-3-28 08:52
感谢楼主
作者: 芋仔61 时间: 2017-3-28 12:16
太赞啦，棒棒哒
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