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标题: 关于质谱exosome or EVs的marker [打印本页]
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-4-23 11:27
标题: 关于质谱exosome or EVs的marker
本帖最后由 hzangs 于 2016-5-11 17:56 编辑

各位大神大家好，近来在实验中发现WB和MS的蛋白鉴定结果又出入呢，一般 CD63和 ALIX 等都是WB能检测到的marker，那么有没有是用质谱能检测的marker呢，因为很多时候能WB出CD63等marker 但是MS检测不到呢？
请各位积极参与讨论，thank u
作者: hzangs    时间: 2016-4-24 15:02
这与质谱有关。 根据我打质谱的经验，一个靠谱的质谱平台可能比质谱仪本身更重要。  我们实验室也遇到过过表达蛋白之后，过表达细胞系和对照细胞系打质谱，然后差异蛋白里没有过表达的那个蛋白的情况。  你这个可能是质谱打的不好 o(╯□╰)o  
作者: seallin    时间: 2016-4-24 15:41
我是专门做质谱的，回答这个问题主要分两点：
1、外泌体的提取。这个很关键，因为外泌体在培养液里，一般质谱上样量不会超过2微克，如果你的蛋白酶解产物中，血清蛋白占了绝大部分，那么结果就可想而知了，鉴定出来的肯定都是血清蛋白。因此，尽可能的除去血清蛋白极其重要，平时做wb外泌体清洗2遍，那么做质谱，请最好清洗3遍4遍。
2、样品预处理和质谱。一般商家的样品预处理都是很普通的方法，不会用很新很好的方法，因此样品处理中损失会很大，还会不可避免的引入SDS和NP40的干扰，影响质谱鉴定。质谱方面：质谱参数很多，许多要按照实际情况进行调节，比如样品复杂就要设长分离梯度；样品血清蛋白多，要设长动态排除时间等等。最后，商品化质谱测样，最好选thermo公司的质谱。
作者: seallin    时间: 2016-4-24 15:51
另外，有几个基因名一不小心会出错。比如大名鼎鼎的ALIX，真正的名字应该是PDCD6IP，还要CD225，真名是IFITM1，所以最后搜索可能会有所遗漏。
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-4-24 16:46
感谢大家的回复
作者: 子非鱼    时间: 2016-4-26 20:21
seallin 发表于 2016-4-24 15:41
我是专门做质谱的，回答这个问题主要分两点：
1、外泌体的提取。这个很关键，因为外泌体在培养液里，一般质 ...

童鞋好，我最近做了质谱，也发现类似问题，在此有几个问题，向您请教：
1.这里您说要清洗外泌体是指什么方法清洗？是超离之后大量PBS超离清洗？那对于试剂盒提取的外泌体可以用PBS重悬后二次沉淀吗，或者甚至三次沉淀......
2.对于血清外泌体打质谱，如何做到外泌体的清洗呢？
PS：实验室里无超离设备。期待您的回复！
作者: seallin    时间: 2016-5-3 09:19
子非鱼 发表于 2016-4-26 20:21
童鞋好，我最近做了质谱，也发现类似问题，在此有几个问题，向您请教：
1.这里您说要清洗外泌体是指什么 ...

很抱歉，这段时间没有上论坛。
如果是超离的话，就尽量用多的上样量，因为每次清洗都会有一定损失，一般建议至少2次以上（PBS）；如果是试剂盒，两次沉淀就够了；qEV的话就太浪费了，不划算
作者: 子非鱼    时间: 2016-5-4 18:17
本帖最后由 子非鱼 于 2016-5-4 18:33 编辑
seallin 发表于 2016-5-3 09:19
很抱歉，这段时间没有上论坛。
如果是超离的话，就尽量用多的上样量，因为每次清洗都会有一定损失，一般 ...

谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！但是细胞培液提取的exo，得到的蛋白比对ExoCarta等数据库，总体还不错。看到您的帖子，知道您擅长LC-MS这块，所以还想请教：SBI提取250ul血清的exo，kit沉淀要加大剂量PBS清洗然后再沉淀吗？二次沉淀时候加多少PBS？（最近的一片报道说PEG6000可以大量且经济的配制类似于kit的提取液，所以已购买PEG6000，决定拿这个来提取血清exo，并进行二次沉淀，就是不清楚要加多少量PBS二次沉淀来去除那些高丰度蛋白。。。有点啰嗦）
另外，因为也要做RNA深度测序，不知您涉及过吗，我提了2次RNA，总量在250ng左右，全部用来电泳，均没有见到条带。想请问一下问题出在那里，是总血清量少，还是冻存的exo的时候必需加trizo，不加就降解完了？期待您的回复！
作者: seallin    时间: 2016-5-5 14:07
子非鱼 发表于 2016-5-4 18:17
谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！ ...

我一般是用PEG8000或者PEG10000，第一次得到的沉淀中加入1mL PBS，千万不要晃，这样重复两次，以去除管壁上的血清，然后再用1 mL PBS重溶，枪头吹打均匀，加入终浓度10% （g/mL）的PEG，4度过夜，第二天离心获得沉淀，沉淀pellet按之前一样，用PBS清洗两遍以去除过量的PEG，最后用RIPA重溶进行破碎……

关键步骤有二点：1）二次沉淀前清洗尽量去除血清；2）二次沉淀后尽量去除PEG；
作者: seallin    时间: 2016-5-5 14:08
子非鱼 发表于 2016-5-4 18:17
谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！ ...

RNA这块我不是很擅长，所以也解决不了你的问题~~祝好运
作者: 子非鱼    时间: 2016-5-5 15:46
本帖最后由 子非鱼 于 2016-5-5 16:19 编辑
seallin 发表于 2016-5-5 14:07
我一般是用PEG8000或者PEG10000，第一次得到的沉淀中加入1mL PBS，千万不要晃，这样重复两次，以去除管壁 ...

很详细，很感谢！！！我提取细胞外泌体就按这个protocol了（看到“过夜“俩字，直觉是细胞配液的提取方法）；
另外，您提取过血清exosome吗？洗涤用多少PBS？
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-5-5 15:57
seallin 发表于 2016-4-24 15:41
我是专门做质谱的，回答这个问题主要分两点：
1、外泌体的提取。这个很关键，因为外泌体在培养液里，一般质 ...

您好：  感谢您的回复，我们现在一般质谱样本制备的方式都是FASP 酶解，溶液体系是碳酸氢铵。加DTT 和IAA 最后是酶。
作者: seallin    时间: 2016-5-5 16:33
子非鱼 发表于 2016-5-5 15:46
很详细，很感谢！！！我提取细胞外泌体就按这个protocol了（看到“过夜“俩字，直觉是细胞配液的提取方法 ...

血清其实就是将培养液浓缩10倍的东东，差不多，由于血清量一般比较少，所以清洗次数差不多就行，量最好不要减少，毕竟血清蛋白浓度极高。告诉你一个诀窍，由于酚红和蛋白之间存在疏水相互作用，因此可以用酚红的颜色程度来判断血清蛋白的污染，一般二次沉淀之后，是不会有蛋白残留的，只有外泌体，所以如果沉淀是雪白色的，那就说明比较纯了。如果带一点浅黄甚至棕色，那肯定没洗干净。这些东西，我肯定不会写在文章里的，文章最近发表在Analyst上，到时候多多引用哦~~
作者: seallin    时间: 2016-5-5 16:36
微泡biomarker 发表于 2016-5-5 15:57
您好：  感谢您的回复，我们现在一般质谱样本制备的方式都是FASP 酶解，溶液体系是碳酸氢铵。加DTT 和IAA ...

没错，FASP对于去燥效果特别好。兼容含NP40和SDS体系，我也是推荐用这个。另外PEG沉淀法不可避免的会引入PEG的干扰，所以FASP比较合适。后续的变性还原烷基化步骤，正如你所说，你说的很正确。
作者: 子非鱼    时间: 2016-5-5 16:43
seallin 发表于 2016-5-5 16:33
血清其实就是将培养液浓缩10倍的东东，差不多，由于血清量一般比较少，所以清洗次数差不多就行，量最好不 ...

太好啦~~祝贺您！！之前还在想跟您要paper之类的...可以把您的paper发过来或者paper链接也行，我想学习学习！我邮箱：jokololo@163.com
Ps：血清exo用SBI提取后就是淡黄色的，所以铁定是不纯的了，多谢您的指点！！
作者: seallin    时间: 2016-5-5 16:51
子非鱼 发表于 2016-5-5 16:43
太好啦~~祝贺您！！之前还在想跟您要paper之类的...可以把您的paper发过来或者paper链接也行，我想学习学 ...

不用客气，大家共同提高，文章才刚刚接收，还没出来呢，等出版了再发给你哈。有蛋白组学、质谱方面的问题可以联系我
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-5-5 19:23
seallin 发表于 2016-5-5 16:33
血清其实就是将培养液浓缩10倍的东东，差不多，由于血清量一般比较少，所以清洗次数差不多就行，量最好不 ...

能不能分享一下 文章的题目啊
作者: 子非鱼    时间: 2016-5-5 19:25
seallin 发表于 2016-5-5 16:51
不用客气，大家共同提高，文章才刚刚接收，还没出来呢，等出版了再发给你哈。有蛋白组学、质谱方面的问题 ...

大神啊~~那文章出版了别忘记发给我；我先分析我的数据，有问题还真得向您请教！
作者: 子非鱼    时间: 2016-5-5 22:27
本帖最后由 子非鱼 于 2016-5-6 11:13 编辑
seallin 发表于 2016-5-5 16:51
不用客气，大家共同提高，文章才刚刚接收，还没出来呢，等出版了再发给你哈。有蛋白组学、质谱方面的问题 ...

请问，有没有什么软件可将蛋白gi号批量转换为GeneID和gene symbol的？
作者: seallin    时间: 2016-5-6 10:17
子非鱼 发表于 2016-5-5 22:27
大神，问题来了：，我的质谱数据是一堆Accession number（蛋白gi号）和蛋白或多肽全称，我想把它 ...

很多网站是可以转化的，比如uniprot.org
作者: minling1977    时间: 2016-5-24 10:23
seallin 发表于 2016-5-5 14:08
RNA这块我不是很擅长，所以也解决不了你的问题~~祝好运

提外泌体的RNA需用专用的小RNA提取试剂盒，可联系美基生物黄经理：13660481570
作者: 丝瓜    时间: 2016-5-25 20:44
seallin 发表于 2016-4-24 15:41
我是专门做质谱的，回答这个问题主要分两点：
1、外泌体的提取。这个很关键，因为外泌体在培养液里，一般质 ...

你好，我的实验也是做蛋白方面的。只是我做血清想做绝对定量的质谱，可是了解下来需要的蛋白量都非常大~~想问你做的那边是多少量呢
作者: seallin    时间: 2016-5-26 20:21
丝瓜 发表于 2016-5-25 20:44
你好，我的实验也是做蛋白方面的。只是我做血清想做绝对定量的质谱，可是了解下来需要的蛋白量都非常大~~ ...

看你用什么方法了，基于质谱的绝对定量不需要太多的样品，几微克足够了
作者: hereissyk    时间: 2016-5-26 20:40
seallin 发表于 2016-5-26 20:21
看你用什么方法了，基于质谱的绝对定量不需要太多的样品，几微克足够了 ...

您好，质谱方面具体问题求教，能否留个邮箱？
作者: 丝瓜    时间: 2016-6-2 09:48
seallin 发表于 2016-5-26 20:21
看你用什么方法了，基于质谱的绝对定量不需要太多的样品，几微克足够了 ...

我咨询过国内的公司，基于质谱的绝对定量比如itraq这种的都要几百微克的蛋白才可以。而普通的串联质谱只能有半定量的效果。
作者: seallin    时间: 2016-6-2 10:06
丝瓜 发表于 2016-6-2 09:48
我咨询过国内的公司，基于质谱的绝对定量比如itraq这种的都要几百微克的蛋白才可以。而普通的串联质谱只 ...

哦，那我只能说实验室的技术肯定是领先服务业的
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-6-2 15:27
seallin 发表于 2016-5-5 16:51
不用客气，大家共同提高，文章才刚刚接收，还没出来呢，等出版了再发给你哈。有蛋白组学、质谱方面的问题 ...

您好： 请教一下 那个血浆用试剂盒提取的外泌体做质谱您有关注或者做过实验吗？ 我最近在做血浆但是结果总是不理想呢。
作者: wjy    时间: 2016-6-11 19:05
hzangs 发表于 2016-4-24 15:02
这与质谱有关。 根据我打质谱的经验，一个靠谱的质谱平台可能比质谱仪本身更重要。  我们实验室也遇到过过 ...

大神，想问一下，你质谱的结果怎么分析啊，我最近也在做质谱，但是对于怎么分析很迷茫，看了文献都是用Mascot来数据分析，还有EXOcarta这数据库怎么用啊？求助。
作者: wjy    时间: 2016-6-11 19:10
seallin 发表于 2016-5-5 16:51
不用客气，大家共同提高，文章才刚刚接收，还没出来呢，等出版了再发给你哈。有蛋白组学、质谱方面的问题 ...

求助，最近再做外泌体的质谱，想咨询一下，这个质谱结果怎么分析呀？
作者: seallin    时间: 2016-6-21 08:29
wjy 发表于 2016-6-11 19:10
求助，最近再做外泌体的质谱，想咨询一下，这个质谱结果怎么分析呀？

前段时间出国了，所以一直没上。质谱一般只是手段，为生物学解决问题的，你在质谱结果方面有什么问题
作者: wjy    时间: 2016-9-27 19:57
seallin 发表于 2016-5-5 16:51
不用客气，大家共同提高，文章才刚刚接收，还没出来呢，等出版了再发给你哈。有蛋白组学、质谱方面的问题 ...

您好 ，最近我外泌体质谱的结果出来了，可是出了结果就很迷茫，不知道怎么分析，想请教您几个问题。首先我是猴细胞来源的外泌体，数据是用uniProt 中的猴源数据库分析的，但是分析出来后我不知道那些是外泌体的蛋白那些事宿主细胞的蛋白，像exocarta这种专门外泌体的数据库里没有猴源的数据库，这种情况我该怎么半呀？
作者: wjy    时间: 2016-9-28 09:42
seallin 发表于 2016-6-21 08:29
前段时间出国了，所以一直没上。质谱一般只是手段，为生物学解决问题的，你在质谱结果方面有什么问题 ...

您好，我拿到质谱数据该在哪里开始分析呀，我是首次做质谱之前对这个也不是很了解，我是做病毒感染细胞分泌的外泌体，做了定性同时还做了定量，想看一下病毒感染的外泌体和正常细胞分泌的外泌体内，上调和下调的蛋白都是跟疾病的关系，迷茫呀，不知道如何入手才能找到这些上调和下调的蛋白跟什么有关？正常你们拿到数据怎么处理呀，



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