外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: PEG聚沉+超速离心 试用报告 ：Sci Rep文章技术重复 [打印本页]
作者: hzangs    时间: 2016-4-26 11:48
标题: PEG聚沉+超速离心 试用报告 ：Sci Rep文章技术重复
本帖最后由 hzangs 于 2017-8-17 11:06 编辑

文章及数据归属本人所有，未经本人书面许可，禁止转载，禁止使用本文数据。如有盗用，本人保留法律追究盗用者责任的权利。

文章进展介绍帖：http://www.exosome.com.cn/forum. ... amp;_dsign=3be6f05a
之前在论坛里跟大家分享了【Sci Rep】上一篇关于使用PEG聚沉+超速离心清洗 的方法分离外泌体的protocol。近几天后台一直有朋友反映说无法重复paper里的数据。在此我将自己试用的数据分享给大家，希望能对大家有所帮助。还请大家尊重我的劳动成果，未经我的许可，请勿使用相关数据及图片。


首先分享我的protocol 给大家：


细胞使用含有10% exosome-free FBS培液培养48小时收培液。


1、蒸馏水121℃灭菌20min，冷却待用。


2、8g PEG6000 +2.922g氯化钠 溶于水中，定容至50mL。


3、0.45um 滤器，过滤除菌待用。


4、培液离心2000g 10min，10000g 30min 除去细胞碎片，上清转移至新管子。


5、培液加入等体积PEG溶液。4°过夜。


6、10000g 离心1h，收的沉淀。


7、沉淀重悬于PBS（极易溶解于PBS），超速离心110000g 70min 收的沉淀。


8、WB 鉴定。




图1：步骤6 沉淀[attach]544[/attach]

图2：丽春红染色[attach]545[/attach]
图3：WB 检测CD63和ALIX[attach]546[/attach]
作者: hzangs    时间: 2016-4-26 14:25
sakura_lan 发表于 2016-4-26 14:18
请问用了多少血清？电镜有做吗？

这是用的细胞上清液。 没有拍电镜
作者: hzangs    时间: 2016-4-26 14:29
sakura_lan 发表于 2016-4-26 14:27
请问用了多少血清？

10%的FBS  培液
作者: wjy    时间: 2016-4-26 20:26
请问一下你的cell1和cell2超速离心是我们正常超速离心的方法分离exosome，就是上清去杂质之后，直接100,000g超速离心两次的样品吗？还有一个想向你咨询一下，你的CD63和ALIX的抗体是哪家公司的呀？货号多少可以告诉我吗？最近想买抗体，所有想咨询一下你的抗体公司，谢谢
作者: wjy    时间: 2016-4-26 20:39
还有一个小小的问题请教，PEG和细胞上清液的样品过夜的时候，有没有搅拌过夜那？还是就混匀后静静的放在4℃冷库那？
作者: hzangs    时间: 2016-4-26 21:19
wjy 发表于 2016-4-26 20:26
请问一下你的cell1和cell2超速离心是我们正常超速离心的方法分离exosome，就是上清去杂质之后，直接100,000 ...

是的。  cell1 超离分离的时候出了点问题，没有收到……

ALIX是CST的  CD63 来自proteintech.
作者: hzangs    时间: 2016-4-26 21:20
wjy 发表于 2016-4-26 20:39
还有一个小小的问题请教，PEG和细胞上清液的样品过夜的时候，有没有搅拌过夜那？还是就混匀后静静的放在4℃ ...

混匀 然后静静的放着，静静会帮你的
作者: wjy    时间: 2016-4-26 22:57
hzangs 发表于 2016-4-26 21:20
混匀 然后静静的放着，静静会帮你的

哈哈哈谢谢解答
作者: wjy    时间: 2016-4-26 23:00
hzangs 发表于 2016-4-26 21:19
是的。  cell1 超离分离的时候出了点问题，没有收到……

ALIX是CST的  CD63 来自proteintech.  ...

可以不可告诉我具体货号那？感觉你的wb图做的棒棒哒哈。想买你的抗体试一试哈～你用过TSG101和CD9的抗体吗？都用哪家公司的那？效果怎么样那？
作者: yueyujiaexo    时间: 2016-4-26 23:00
你好，你的第一次离心就用的10000g, 有没有试过文献里的3000g呢？ 谢谢。 我们实验室的离心机达不到10000g, 要超离， 但是超离的管子形状又很纠结，很难收集沉淀。
作者: wjy    时间: 2016-4-26 23:10
hzangs 发表于 2016-4-26 21:19
是的。  cell1 超离分离的时候出了点问题，没有收到……

ALIX是CST的  CD63 来自proteintech.  ...

刚查了一下是cell signaling 的2171 ALIX（3A9）鼠单抗吗？
作者: hzangs    时间: 2016-4-26 23:11
wjy 发表于 2016-4-26 23:00
可以不可告诉我具体货号那？感觉你的wb图做的棒棒哒哈。想买你的抗体试一试哈～你用过TSG101和CD9的抗体 ...

ALIX #2171（CST）
CD63 #25682-1-AP （proteintech）
TSG101 #ab133586 （abcam）
这三只抗体的效果都很好。 你可以尝试。 我一直用的都是这三个。
CD9 没有用过。  希望这些东西对你有所帮助
作者: hzangs    时间: 2016-4-26 23:12
yueyujiaexo 发表于 2016-4-26 23:00
你好，你的第一次离心就用的10000g, 有没有试过文献里的3000g呢？ 谢谢。 我们实验室的离心机达不到10000g, ...

第一次 3000g 我还真没有尝试过。
只要有沉淀，基本里面就有外泌体的~
作者: wjy    时间: 2016-4-26 23:13
hzangs 发表于 2016-4-26 23:11
ALIX #2171（CST）
CD63 #25682-1-AP （proteintech）
TSG101 #ab133586 （abcam）

非常的感谢 你哈 莫名的崇拜哈
作者: hzangs    时间: 2016-4-26 23:15
wjy 发表于 2016-4-26 23:13
非常的感谢 你哈 莫名的崇拜哈

论坛嘛， 就是大家相互讨论，相互帮助的地方。不用谢~
作者: Bridgen桥生物    时间: 2016-4-27 14:07
hzangs 发表于 2016-4-26 23:15
论坛嘛， 就是大家相互讨论，相互帮助的地方。不用谢~

很不错的呀，这么给我们分享，给力呀。
作者: pengqiao0605    时间: 2016-4-27 14:49
请问楼主收集这些沉淀用了多少的细胞上清？
作者: hzangs    时间: 2016-4-27 16:01
pengqiao0605 发表于 2016-4-27 14:49
请问楼主收集这些沉淀用了多少的细胞上清？

这是一个外泌体释放量十分大的细胞。  收集这些外泌体 大概用了7ml 培液
作者: pengqiao0605    时间: 2016-4-27 16:10
哇塞，你用的这细胞可真够给力的。我用的是T淋巴细胞系100ml上清也就做了个电镜。
作者: hzangs    时间: 2016-4-27 16:54
本帖最后由 hzangs 于 2016-5-18 14:10 编辑
pengqiao0605 发表于 2016-4-27 16:10
哇塞，你用的这细胞可真够给力的。我用的是T淋巴细胞系100ml上清也就做了个电镜。 ...

你用 巨噬细胞  或者 胰腺癌细胞 就知道了   那产量，简直是细胞把自己粉碎了 然后往外吐 exosome啊！
可能分泌旺盛的细胞  外泌体释放量会比较高。
作者: wxhljq    时间: 2016-4-27 17:19
本帖最后由 hzangs 于 2016-4-27 17:44 编辑

你觉得这方法得到的杂蛋白多么？
作者: hzangs    时间: 2016-4-27 17:46
wxhljq 发表于 2016-4-27 17:19
你觉得这方法得到的杂蛋白多么？

PEG+超速离心清洗  这个方法还可以。
如果你用一个十几毫升或者几十毫升PBS的体系进行清洗这一步的话，结果杂蛋白量应该会和超速离心差不多，甚至比超速离心效果好。  如果你后面洗的这一步 用小体系进行清洗的话  可能杂蛋白会多一些。 但总体讲 要比单纯沉淀的方法 好不少。
作者: Jimson    时间: 2016-4-27 23:28
本帖最后由 Jimson 于 2016-4-27 23:43 编辑

如果有电镜结果就完美了。顶顶顶
作者: 子非鱼    时间: 2016-4-28 11:24
斑竹，用来做细胞功能的exo是需要新鲜提的呢？还是也可以冻起来？我做了两次，都是把exo提出来放4度，等细胞准备好了，再对细胞处理，但是因为有的时候不凑巧，而exo又不能在4度存放超过一周。看文献总是说提取exo后-80度保存备用，不知道这个适用于功能试验吗
作者: hzangs    时间: 2016-4-28 12:44
子非鱼 发表于 2016-4-28 11:24
斑竹，用来做细胞功能的exo是需要新鲜提的呢？还是也可以冻起来？我做了两次，都是把exo提出来放4度，等细 ...

这个 我没有做过尝试   你可以试一试。
作者: 子非鱼    时间: 2016-4-29 22:43
hzangs 发表于 2016-4-28 12:44
这个 我没有做过尝试   你可以试一试。

那我也不尝试了。。。
作者: hzangs    时间: 2016-4-29 23:22
子非鱼 发表于 2016-4-29 22:43
那我也不尝试了。。。

作者: 思想滚得远    时间: 2016-5-2 11:55
hzangs 发表于 2016-4-27 16:54
你用  DC细胞  或者MSC  或者 胰腺癌细胞 就知道了   那产量，简直是细胞把自己粉碎了 然后往外吐 ex ...

请问是无血清培养基提的Exosome么，还是去exosome血清培养基提取的exosome，我用MSC无血清培养基并不能看到大量沉淀
作者: hzangs    时间: 2016-5-2 12:26
思想滚得远 发表于 2016-5-2 11:55
请问是无血清培养基提的Exosome么，还是去exosome血清培养基提取的exosome，我用MSC无血清培养基并不能看 ...

我使用的是 去除exosome的血清。
作者: 思想滚得远    时间: 2016-5-2 13:09
hzangs 发表于 2016-5-2 12:26
我使用的是 去除exosome的血清。

是SBI的那种去exosome血清么 还是自己超离去除的exosome
作者: hzangs    时间: 2016-5-2 13:26
思想滚得远 发表于 2016-5-2 13:09
是SBI的那种去exosome血清么 还是自己超离去除的exosome

自己超离去除的
作者: yayinano    时间: 2016-5-4 13:48
群主，你好，最近使用了你给出来的protocol，我用的是病人抽出来的血清（本人医生），1ml血清，加了1ml的PEG溶液（按照你的方法配的），4度静止放了一晚，第二天离心之后，发现了大量的沉淀，加了1ml的PBS之后，需要用枪吹才能溶解，而后我怕怀疑是大量的蛋白沉淀而已，我把溶解的PBS溶液再次离心了1h 10000g，并没有发现任何的沉淀，由于没有超离的离心机，最后一个步骤无法进行，本人想做外泌体的microRNA，这样的结果能可信吗？还是要做western确定一下？
作者: hzangs    时间: 2016-5-4 14:52
yayinano 发表于 2016-5-4 13:48
群主，你好，最近使用了你给出来的protocol，我用的是病人抽出来的血清（本人医生），1ml血清，加了1ml的PE ...

你还是需要参考一下原文的。  只是我根据之前的一篇文献提供的方法做的。  你要读一下原文  看看他们是怎么做的。  我发这个帖子  主要目的就是验证一下他们方法的可行性，没有再做更多的尝试。
作者: yayinano    时间: 2016-5-4 15:23
谢谢楼主，我在具体看下，血清的，文章里面也没有很具体的描述，头疼中，还有一个技术问题想问下群主，exosomal miRNA的qPCR的内参选择什么合适?跪求指导~
作者: 5五吾    时间: 2016-5-4 21:18
请问用0.22um的filter可以吗？
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-5-5 14:36
请问一下 楼主的WB的最小上样量是多少微克呢？
作者: hzangs    时间: 2016-5-5 17:59
微泡biomarker 发表于 2016-5-5 14:36
请问一下 楼主的WB的最小上样量是多少微克呢？

这个很难说。   几个微克 肯定是够的
作者: 5五吾    时间: 2016-5-6 09:11
请教下，楼主，我用0.22um的滤器不会对PEG有影响吧？
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-5-6 09:12
hzangs 发表于 2016-5-5 17:59
这个很难说。   几个微克 肯定是够的

那问一下楼主，你的WB的上样量 是多少啊
作者: hzangs    时间: 2016-5-6 09:34
微泡biomarker 发表于 2016-5-6 09:12
那问一下楼主，你的WB的上样量 是多少啊

一般最少5个微克
作者: hzangs    时间: 2016-5-6 09:35
5五吾 发表于 2016-5-4 21:18
请问用0.22um的filter可以吗？

额   这个 要试过才知道
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-5-6 10:28
hzangs 发表于 2016-5-6 09:34
一般最少5个微克

那问一下 您是干转还是湿转呢
作者: hzangs    时间: 2016-5-6 10:39
微泡biomarker 发表于 2016-5-6 10:28
那问一下 您是干转还是湿转呢

湿转。
很多时候，WB的决定因素是抗体…  抗体够好的话  一点点蛋白就够了
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-5-6 12:17
hzangs 发表于 2016-5-6 10:39
湿转。
很多时候，WB的决定因素是抗体…  抗体够好的话  一点点蛋白就够了 ...

好的 谢谢啦
作者: Siberia    时间: 2016-5-6 14:51
请问您超离的程序是啥？加速度多少，降速多少？
谢谢您！
作者: hzangs    时间: 2016-5-6 15:33
Siberia 发表于 2016-5-6 14:51
请问您超离的程序是啥？加速度多少，降速多少？
谢谢您！

最高加减速。  离心力100000~110000g
作者: 微泡biomarker    时间: 2016-5-6 16:30
hzangs 发表于 2016-5-6 10:39
湿转。
很多时候，WB的决定因素是抗体…  抗体够好的话  一点点蛋白就够了 ...

能再问一下 你的抗体 是多少比例加的吗
作者: hzangs    时间: 2016-5-6 19:19
微泡biomarker 发表于 2016-5-6 16:30
能再问一下 你的抗体 是多少比例加的吗

1:3000~
作者: 淘芝夭夭    时间: 2016-5-8 15:43
你好 好像看到超离后的沉淀不是很明显啊
作者: hzangs    时间: 2016-5-8 15:52
淘芝夭夭 发表于 2016-5-8 15:43
你好 好像看到超离后的沉淀不是很明显啊

额    这个已经很明显了。  如果你用经典的超离方法，沉淀基本照片是看不到的
作者: 淘芝夭夭    时间: 2016-5-9 09:58
我们差速超离时基本没看到任何沉淀
作者: clavichord    时间: 2016-5-10 21:29
原文已看，文中的z-stacks是个什么意思
作者: clavichord    时间: 2016-5-10 21:44
hzangs 发表于 2016-4-27 16:54
你用  DC细胞  或者MSC  或者 胰腺癌细胞 就知道了   那产量，简直是细胞把自己粉碎了 然后往外吐 ex ...

楼主做过msc？？
作者: clavichord    时间: 2016-5-10 21:47
hzangs 发表于 2016-5-2 12:26
我使用的是 去除exosome的血清。

可能血清中也有相关蛋白
作者: clavichord    时间: 2016-5-10 21:49
5五吾 发表于 2016-5-4 21:18
请问用0.22um的filter可以吗？

这个我也好奇呢
作者: clavichord    时间: 2016-5-10 22:49
为什么去除血清的外泌体的方法是10万离心速度，20h？？？不能优化了么
作者: hzangs    时间: 2016-5-11 10:29
clavichord 发表于 2016-5-10 21:44
楼主做过msc？？

我不做MSC
作者: lenoch    时间: 2016-5-11 12:49
5五吾 发表于 2016-5-4 21:18
请问用0.22um的filter可以吗？

我用的是0.22的，个人感觉会使exosome更纯一些，至少220nm以上的都滤掉了。会使你的电镜和nanosight更好看。所以我建议你做这两个时候用这方法，如果要做现象，需要更多的EV，就用0.45，这样得率会高很多。至少，大家都是MV。
作者: woshiyywlly    时间: 2016-5-12 14:42
我按前面的步骤试了下，同时取相同体积的培液，用Life的exosome isolation kit 作为对照，离心后目测PEG提出来的要比life的试剂盒少一半的样子，沉淀还没洗，不知道洗完之后还能剩多少exosome
作者: hzangs    时间: 2016-5-12 18:39
woshiyywlly 发表于 2016-5-12 14:42
我按前面的步骤试了下，同时取相同体积的培液，用Life的exosome isolation kit 作为对照，离心后目测PEG提 ...

感谢分享   单看沉淀 好像意义不大。 毕竟 大部分都是杂蛋白。  还是要看洗一次 超离后的量了~
作者: clavichord    时间: 2016-5-13 14:15
The next day, samples were
centrifuged in a tabletop centrifuge at maximum speed (Eppendorf, model 5810 R using an S-4-104 swing bucket
rotor; 3,214 g) for 1 hour at 4 °C.文中用的是3214g，您用的是10000g？
作者: hzangs    时间: 2016-5-13 14:31
clavichord 发表于 2016-5-13 14:15
The next day, samples were
centrifuged in a tabletop centrifuge at maximum speed (Eppendorf, model 5 ...

是的。  我对他的这个描述 表示不信任。  所以 直接上10000g的
作者: hellfight    时间: 2016-5-13 16:06
lz有没有做过前列腺癌的细胞，它们外泌体分泌多吗
作者: zqlhiiaxyz    时间: 2016-5-13 16:30
没有超速离心机，作者给的8%PEG+washing法的洗涤PEG这步没法做。有没人试过用8%PEG+5%PEG法呢？我看作者给的图中显示这种方法没有PEG+超离washing效果好，但好像比试剂盒效果好。
作者: yulia    时间: 2016-5-13 16:59
hzangs 发表于 2016-5-2 12:26
我使用的是 去除exosome的血清。

怎么去掉exosome？有专门无exosome的血清卖吗？
作者: yulia    时间: 2016-5-13 17:01
hzangs 发表于 2016-5-2 13:26
自己超离去除的

版主，是先把血清超离去掉exosome，再配置含10%FBS的培基？还是配置好含10%FBS培基后，把培基超离？你用的哪种方式？
作者: yulia    时间: 2016-5-13 17:09
lenoch 发表于 2016-5-11 12:49
我用的是0.22的，个人感觉会使exosome更纯一些，至少220nm以上的都滤掉了。会使你的电镜和nanosight更好 ...

说得有道理
作者: yulia    时间: 2016-5-13 17:13
把帖子挨篇都看完了，谢谢楼主的倾情分享
作者: yulia    时间: 2016-5-13 17:47
版主，你使用的是哪个公司的PEG6000
作者: hzangs    时间: 2016-5-13 20:19
yulia 发表于 2016-5-13 17:47
版主，你使用的是哪个公司的PEG6000

生工生物
作者: yulia    时间: 2016-5-14 15:20
版主，是先把血清超离去掉exosome，再配置含10%FBS的培基？还是配置好含10%FBS培基后，把培基超离？你用的哪种方式？
作者: hzangs    时间: 2016-5-14 22:51
yulia 发表于 2016-5-14 15:20
版主，是先把血清超离去掉exosome，再配置含10%FBS的培基？还是配置好含10%FBS培基后，把培基超离？你用的 ...

前者~
作者: 陆峰彬    时间: 2016-5-18 14:05
hzangs 发表于 2016-4-27 16:54
你用  DC细胞  或者MSC  或者 胰腺癌细胞 就知道了   那产量，简直是细胞把自己粉碎了 然后往外吐 ex ...

版主你好，请问MSC外泌体分泌多？具体有多少？有提过的说100ml也就10ug，现在实验提取，不知道自己提的怎么样，想请教一下，谢谢
作者: hzangs    时间: 2016-5-18 14:08
陆峰彬 发表于 2016-5-18 14:05
版主你好，请问MSC外泌体分泌多？具体有多少？有提过的说100ml也就10ug，现在实验提取，不知道自己提的怎 ...

MSC 外泌体我没有做过具体的分离尝试。 但是因为周围有人做MSC的外泌体。 只是问过，说产量很可观。
作者: jeff    时间: 2016-5-19 11:56
不洗可以吗？life的kit里面好像也没有洗。。。
作者: hzangs    时间: 2016-5-19 13:11
jeff 发表于 2016-5-19 11:56
不洗可以吗？life的kit里面好像也没有洗。。。

最好还是洗洗    不然 杂蛋白太多了
作者: whjy2004    时间: 2016-5-19 16:10
请问楼主 ：制备exosome-free FBS 的离心条件？转速和时间
作者: hzangs    时间: 2016-5-19 17:23
whjy2004 发表于 2016-5-19 16:10
请问楼主 ：制备exosome-free FBS 的离心条件？转速和时间

110000g  14-16h~
作者: 冷雪儿翱翔    时间: 2016-5-20 09:25
hzangs 发表于 2016-4-27 16:01
这是一个外泌体释放量十分大的细胞。  收集这些外泌体 大概用了7ml 培液

细胞那么给力？赞！
作者: 子非鱼    时间: 2016-5-20 11:42
hzangs 发表于 2016-4-26 23:12
第一次 3000g 我还真没有尝试过。
只要有沉淀，基本里面就有外泌体的~

斑竹，我用ExtraPEG，提取培液没有看到沉淀。之前用SBI的kit提取8ml就能见沉淀了，上质谱的结果与ExoCarta能match到89%，所以一开始用ExtraPEG时候，用7ml的培养基，没有见到沉淀；然后又增加到24ml的量，提取，加同等体积的PEG6000，还是没有见到沉淀....我用的4000g离心的（我知道楼主此处用10000g，但是我同时提取血清的外泌体，4000g没问题的），所以想请楼主帮忙分析下可能的问题....多谢！
作者: hzangs    时间: 2016-5-20 20:18
子非鱼 发表于 2016-5-20 11:42
斑竹，我用ExtraPEG，提取培液没有看到沉淀。之前用SBI的kit提取8ml就能见沉淀了，上质谱的结果与ExoCart ...

PEG 是按照我说的那个配置的么？  16%的？  混匀了没？
作者: 子非鱼    时间: 2016-5-20 21:26
hzangs 发表于 2016-5-20 20:18
PEG 是按照我说的那个配置的么？  16%的？  混匀了没？

是照您说的，上下颠倒了十几次，应该混匀了，16%的，就是配置的时候忘记用高压过得ddH2O了，配置完后0.22um过滤的
作者: lilingexosome    时间: 2016-5-21 18:56
hzangs 发表于 2016-5-4 14:52
你还是需要参考一下原文的。  只是我根据之前的一篇文献提供的方法做的。  你要读一下原文  看看他们是怎 ...

我想请问一下能不能提供一下文献题目呀，我是新手才进来的，看不到呀，谢谢
作者: hzangs    时间: 2016-5-22 18:01
lilingexosome 发表于 2016-5-21 18:56
我想请问一下能不能提供一下文献题目呀，我是新手才进来的，看不到呀，谢谢 ...

http://www.exosome.com.cn/forum. ... &extra=page%3D1
这里有原文
作者: Mars    时间: 2016-5-24 12:40
hzangs 发表于 2016-4-27 17:46
PEG+超速离心清洗  这个方法还可以。
如果你用一个十几毫升或者几十毫升PBS的体系进行清洗这一步的话，结 ...

这一步是不是文献里最后100000g超高速离心前用PBS洗啊？你用多少啊？文献里说的是1ml
作者: hzangs    时间: 2016-5-24 12:49
Mars 发表于 2016-5-24 12:40
这一步是不是文献里最后100000g超高速离心前用PBS洗啊？你用多少啊？文献里说的是1ml
...

我秀的数据中  是用了1ml
现在我用这个方法的时候 会用30ml
作者: katuysha    时间: 2016-5-24 15:51
楼主，你好，我是新手，想问一下重悬用的PBS是不是也要进行预处理，如果需要，该进行什么样的处理？
作者: hzangs    时间: 2016-5-24 17:57
katuysha 发表于 2016-5-24 15:51
楼主，你好，我是新手，想问一下重悬用的PBS是不是也要进行预处理，如果需要，该进行什么样的处理？ ...

高压灭菌，然后 0.22um的滤器 再过滤除去PBS里的颗粒。
作者: Mars    时间: 2016-5-25 13:37
hzangs 发表于 2016-5-24 17:57
高压灭菌，然后 0.22um的滤器 再过滤除去PBS里的颗粒。

买现成的PBS可以吗
作者: hzangs    时间: 2016-5-25 13:57
Mars 发表于 2016-5-25 13:37
买现成的PBS可以吗

可以的呀。  那就不用过滤了。  我们用的都是自己配的PBS
作者: pkuaction    时间: 2016-5-27 08:59
本人外泌体新手，请教您一个小问题：第7步通过PEG6000沉淀低速离心收集后加入ＰＢＳ重悬后，超高速离心的目的是什么，效果怎么样？发现ＳＢＩ与ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ的提取试剂盒一般都没有最后一步，请楼主指教。本人实验室没有超速离心机
作者: hzangs    时间: 2016-5-27 09:55
pkuaction 发表于 2016-5-27 08:59
本人外泌体新手，请教您一个小问题：第7步通过PEG6000沉淀低速离心收集后加入ＰＢＳ重悬后，超高速离心的目 ...

最后一步的目的是去除杂蛋白。  沉淀法容易带杂蛋白下来，最后用PBS洗一下
作者: katuysha    时间: 2016-5-30 13:09
hzangs 发表于 2016-5-24 17:57
高压灭菌，然后 0.22um的滤器 再过滤除去PBS里的颗粒。

谢谢楼主的回复，！
作者: hzangs    时间: 2016-5-30 13:13
katuysha 发表于 2016-5-30 13:09
谢谢楼主的回复，！

太可气了
作者: pytruth    时间: 2016-5-31 16:01
楼主，想咨询一下，从细胞上清液提取小囊泡，怎么知道这个细胞外泌体分泌的多不多呢？如何确定需要用多少毫升的上清液来提取外泌体？另外就是这个PEG法提取效果和用试剂盒提取相比怎么样呢？
作者: hzangs    时间: 2016-5-31 17:39
pytruth 发表于 2016-5-31 16:01
楼主，想咨询一下，从细胞上清液提取小囊泡，怎么知道这个细胞外泌体分泌的多不多呢？如何确定需要用多少毫 ...

细胞释放外泌体的量多不多 只能通过自己做实验逐渐尝试。  一般分泌量中等的细胞系使用60ml上清提外泌体是可以的。   PEG法提取效果和沉淀试剂盒 差不多，但相比超速离心分离 还是差了些。
作者: Mars    时间: 2016-5-31 19:56
hzangs 发表于 2016-5-27 09:55
最后一步的目的是去除杂蛋白。  沉淀法容易带杂蛋白下来，最后用PBS洗一下 ...

问一下，你在用100000g超速离心前要把原先细胞上清和PEG混合液先浓缩一下吗
作者: hzangs    时间: 2016-6-1 08:19
Mars 发表于 2016-5-31 19:56
问一下，你在用100000g超速离心前要把原先细胞上清和PEG混合液先浓缩一下吗 ...

是将Peg沉淀下来的东西 PBS重悬，然后超离
作者: Mars    时间: 2016-6-1 09:33
hzangs 发表于 2016-6-1 08:19
是将Peg沉淀下来的东西 PBS重悬，然后超离

是不是文献里说的3214g，1h，4℃后的沉淀然后PBS重悬超离
作者: hzangs    时间: 2016-6-1 10:34
Mars 发表于 2016-6-1 09:33
是不是文献里说的3214g，1h，4℃后的沉淀然后PBS重悬超离

嗯嗯。是的



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