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标题: 第一次超离心WB结果，求大神帮忙看一看 [打印本页]
作者: dengsilong1991    时间: 2016-5-26 16:20
标题: 第一次超离心WB结果，求大神帮忙看一看
第一次用超离心分离exo，离心程序2000g 20min-10000g 30min-100000g 2h-100000g 2h，离心后沉淀很少，用80ulPBS重悬后，加入loading buffer，95度 5min煮，然后按6ul 8ul 10ul上样，用calnexin、TSG101、CD9杂条带，结果可以看到，cal仍然存在说明exo不纯，TSG101显出了条带，但CD9完全没有显出(CD9抗体之前有用别的蛋白验证过，没有问题)。想求问一下各位大神，超离心后的exo的WB是否可以做出干净的条带(无阴性marker)？或者是需要进一步纯化才行？另外，我之前试过小鼠血清提取的exo，CD9也很淡；这次用的是CHO细胞，完全没有CD9，是不是CD9在这些exo可能没有表达？谢谢！！
作者: hzangs    时间: 2016-5-26 20:12
你这个怎么没有 cell lysis的对照……   没有细胞对照   不好讲啊……
作者: dengsilong1991    时间: 2016-5-27 15:19
hzangs 发表于 2016-5-26 20:12
你这个怎么没有 cell lysis的对照……   没有细胞对照   不好讲啊……

因为是第一次超离，我的培养基还是多次收集的，想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的exo的纯度吗？分离的exo的阴性marker要怎样才能除去呢？请前辈赐教。
作者: hzangs    时间: 2016-5-27 15:30
dengsilong1991 发表于 2016-5-27 15:19
因为是第一次超离，我的培养基还是多次收集的，想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的 ...

这个我不太清楚。  你最好还是要杂一下 cell lysis    这样才能大概反映出 你的样品里 不是exosomes的组分影响大概有多大。  不然 你这个没办法评判啊……
作者: hzangs    时间: 2016-5-27 15:34
dengsilong1991 发表于 2016-5-27 15:19
因为是第一次超离，我的培养基还是多次收集的，想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的 ...

你不杂cell lysis  
就好比告诉我你发现一堆水果里有几个水果是坏了， 而你不告诉这一堆水果总共有多少个。
如果只有10个果子， 几个坏了 那确实说明有问题。如果数千个果子 只有几个坏了， 那没事啊。

如果你杂cell lysis   和exosomes样品上同样的蛋白量。  发现 阴性marker在cell lysis里已经过曝了，而exosomes样品里只有一点点， 那就说明 你的污染不是很重， 直接忽视就好。 而如果两者接近，那就说明污染很严重，样品不能当做exosomes样品了。
作者: dengsilong1991    时间: 2016-5-27 15:34
恩，好的，我这次离心把cell也带上，谢谢前辈！
作者: 陆峰彬    时间: 2016-6-1 19:04
hzangs 发表于 2016-5-27 15:34
你不杂cell lysis  
就好比告诉我你发现一堆水果里有几个水果是坏了， 而你不告诉这一堆水果总共有多少个 ...

请问版主你怎么保证外泌体和细胞上的蛋白量相同，BCA不是很精确，内参选什么？
作者: 小孔加油    时间: 2016-6-22 20:35
请问您一次超离多少培养基得到的外泌体，才能保证做western的量？谢谢！
作者: 小孔加油    时间: 2016-6-22 20:37
请问您是80ul PBS重悬外泌体后，直接加loading 煮的，没有经过裂解液提取蛋白那一步吗？
作者: dengsilong1991    时间: 2016-6-23 09:32
小孔加油 发表于 2016-6-22 20:35
请问您一次超离多少培养基得到的外泌体，才能保证做western的量？谢谢！

我也才超离过三次，前两次是60ml离心，80ul溶解，直接loading buffer煮后，10ul上样，能见条带
作者: 胖子的心境    时间: 2016-6-23 15:48
dengsilong1991 发表于 2016-6-23 09:32
我也才超离过三次，前两次是60ml离心，80ul溶解，直接loading buffer煮后，10ul上样，能见条带 ...

都不用裂解，直接煮吗？？？？？
作者: dengsilong1991    时间: 2016-6-27 16:04
胖子的心境 发表于 2016-6-23 15:48
都不用裂解，直接煮吗？？？？？

是的，直接加buffer煮
作者: 小孔加油    时间: 2016-7-4 15:34
您好，想请教一下,是，离心之后，用80ul PBS溶解，80ul里加多少loading buffer煮的呢？PBS能换成蛋白裂解液吗？
作者: dengsilong1991    时间: 2016-7-7 11:05
小孔加油 发表于 2016-7-4 15:34
您好，想请教一下,是，离心之后，用80ul PBS溶解，80ul里加多少loading buffer煮的呢？PBS能换成蛋白裂解液 ...

我用的是4xloading buffer，所以80里面加27就行了，蛋白裂解液是5x的，所以也得用PBS稀释啊
作者: grapetian    时间: 2016-7-11 17:39
我sbi试剂盒提取细胞培养上清的exosome，alix,cd63能跑出来，calnexin阴性，但是cd9也没有，我同时做了细胞裂解液的,虽然cd9有，但是丰度远比alix,cd63低
作者: 五月灼蓁    时间: 2017-5-19 18:55
dengsilong1991 发表于 2016-7-7 11:05
我用的是4xloading buffer，所以80里面加27就行了，蛋白裂解液是5x的，所以也得用PBS稀释啊 ...

请问一下，如果用1x的裂解液，可以直接加吗?
另外我看到网站里有人说用非还原性的loading buffer,那配裂解液的时后是不是不加DTT就可以了
作者: zzycircle    时间: 2017-5-27 20:27
楼主请问你血清提取外泌体 是用多少的血清加多少的PBS超离的？谢谢
作者: zzlttbbest    时间: 2017-6-14 17:17
请问，超速离心后的外泌体很容易重悬成液相么？我用猪精液上清超离收集外泌体，1000g、20min，16000g、60min，0.45、0.22um过滤，120000g、120min。收集到的沉淀结成胶冻样沉淀，结成一坨呈固态，吹打震荡都无法重悬。另外收集到的外泌体直接加loading变性跑WB，加loading的量怎么控制嫩？
作者: weixiao    时间: 2020-6-30 10:17
你好，我想请问下这个细胞裂解液说的是细胞上清吗？




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