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标题: 菜鸟求助 细胞培养上清SBI 试剂外泌体分离 [打印本页]
作者: muzi.csu    时间: 2015-1-24 16:33
标题: 菜鸟求助 细胞培养上清SBI 试剂外泌体分离
用SBI公司的Exoquick-TC分离肿瘤细胞培养上清中的外泌体。刚开始用无血清培基培养肿瘤细胞，48小时后收集上清（5ml），加入试剂过夜后离心未发现沉淀。后来用10%的普通胎牛血清培养细胞，离心后沉淀较多。但是因为胎牛血清中含有胎牛的外泌体，所以后来又换成了SBI公司的EXO-free的血清10%培养细胞，48小时候收集上清，离心却又未见沉淀。而文献报道该肿瘤细胞可分泌大量外泌体，但是不知道为什么我分离不出来...  麻烦各位大神指教啊，不胜感激
作者: muzi.csu    时间: 2015-1-25 09:37
Johnny 发表于 2015-1-24 19:11
你好，5ml的上清量太少。建议加大上清量。
另外，请问SBI公司的EXO-free的血清是从哪儿买的？ ...

谢谢，我加大上清再试试！
EXO-free的血清是买的SBI公司的，不过SBI好像没有专门的代理商，所以随便找的试剂商（青木公司）买的。
作者: ffp1988    时间: 2015-1-25 19:31
注意细胞的量，细胞太少也不行
作者: muzi.csu    时间: 2015-1-26 08:30
ffp1988 发表于 2015-1-25 19:31
注意细胞的量，细胞太少也不行

好的，非常感谢
作者: muzi.csu    时间: 2015-1-31 15:26
我又用10ml和15ml的细胞培养上清分别做了一次（3×106个细胞培养48小时），但是离心后还是看不见沉，请问有谁知道是怎么回事么,请大家不吝指教啊...
作者: muzi.csu    时间: 2015-2-1 14:37
Johnny 发表于 2015-1-31 16:58
有可能还是太少，你的细胞分泌的exo量少

好忧伤...我再加大量还有换个细胞系试试  谢谢了
作者: 丁倩倩    时间: 2015-2-5 18:46
muzi.csu 发表于 2015-1-31 15:26
我又用10ml和15ml的细胞培养上清分别做了一次（3×106个细胞培养48小时），但是离心后还是看不见沉，请问有 ...

看不到沉淀不代表没有吧，可能比较少，我之前用过一次SBI的提取试剂盒也没看到沉淀，但你需要继续往下做鉴定才能确定到底有没有
作者: muzi.csu    时间: 2015-2-6 09:09
丁倩倩 发表于 2015-2-5 18:46
看不到沉淀不代表没有吧，可能比较少，我之前用过一次SBI的提取试剂盒也没看到沉淀，但你需要继续往下做 ...

( ⊙ o ⊙ ) 这样啊，我之前没看到沉淀的以为没有就都没管了......非常感谢
作者: yy8651    时间: 2015-3-10 15:24
细胞培养诸位都是用什么容器？
作者: effiezhang66    时间: 2015-4-23 10:55
求问用EXO-quick, 为什么过夜后对离心的要求这么低啊，1500g就可以了？还有提完了如果想浓缩，各位大神都怎么操作啊，谢谢啦
作者: effiezhang66    时间: 2015-4-23 11:06
大神我是用的细胞培养基，SBI的盒子，10ml培养基+2ml提取液过夜后，分到1.5mlEP管里离心，因为觉得SBI说明书的转速太低，所以最后会加一次10000g，希望EV可以贴在离心管壁，用了pbs重悬，现在想把多个小管合在一起，所以想浓缩。谢谢！
作者: effiezhang66    时间: 2015-4-23 11:15
是的大神，因为后续想treat细胞用，并且有没有好的测浓度的方法啊？除了BCA
作者: effiezhang66    时间: 2015-4-23 11:23
那如果PBS重悬后要提蛋白怎么办呢？10000离心后加RIPA会损失很多吧？55555555
作者: yy8651    时间: 2015-4-23 17:05
可以试试浓缩细胞培养液
作者: 宝莲    时间: 2015-4-23 19:18
我用life的试剂盒，20ml无血清的细胞培养上清提取也没有沉淀，做电镜可以看到少量外泌体。
作者: muzi.csu    时间: 2015-4-27 12:43
好像可以收集大量细胞上清，用超滤离心管浓缩一下，再用试剂盒分离外泌体。我之前用5,10,15ml细胞上清都没看见沉淀，后来收集了70ml浓缩后再分离就看到沉淀了...
作者: 六月の雪    时间: 2015-4-29 14:47
muzi.csu 发表于 2015-4-27 12:43
好像可以收集大量细胞上清，用超滤离心管浓缩一下，再用试剂盒分离外泌体。我之前用5,10,15ml细胞上清都没 ...

求指教，如何浓缩的，用的什么规格的超滤离心管，另外，你的Exo-Free的SBI血清是多少钱买的啊？
作者: yy8651    时间: 2015-4-29 16:28
六月の雪 发表于 2015-4-29 14:47
求指教，如何浓缩的，用的什么规格的超滤离心管，另外，你的Exo-Free的SBI血清是多少钱买的啊？ ...

据有人说250ml   7K左右
作者: muzi.csu    时间: 2015-5-12 15:54
六月の雪 发表于 2015-4-29 14:47
求指教，如何浓缩的，用的什么规格的超滤离心管，另外，你的Exo-Free的SBI血清是多少钱买的啊？ ...

我买的是3KD的  15ml的超滤管。exo-free好像是将近2000元买的小规格
作者: daidiu2003    时间: 2015-5-18 22:34
请问“用SBI公司的Exoquick-TC分离肿瘤细胞培养上清中的外泌体”，Exoquick-TC有说明书吗？是按着说明书操作就好？可以跟你请教点详细的实验步骤不？我们也是实验条件有限，老板胸怀大志。。。好担心不能毕业~~谢谢你了~
作者: 六月の雪    时间: 2015-5-19 18:33
daidiu2003 发表于 2015-5-18 22:34
请问“用SBI公司的Exoquick-TC分离肿瘤细胞培养上清中的外泌体”，Exoquick-TC有说明书吗？是按着说明书操 ...

https://www.systembio.com/micror ... exosomes/literature
SBI公司官网有说明书下载
作者: bobo    时间: 2015-5-26 19:40
muzi.csu 发表于 2015-5-12 15:54
我买的是3KD的  15ml的超滤管。exo-free好像是将近2000元买的小规格

请问，这个超滤管是什么牌子的呢？用多少转数离心呢？离心后用什么重悬呢？为什么选择3KD的呢？
作者: evomicscience    时间: 2015-6-1 03:35
PEG-based exosome isolation method is not accepted by most of researchers in this year ISEV meeting yet. Actually, rejected! Most is seeking other products. The problem of this kind of method is that the both purity and yield are too low.
作者: yy8651    时间: 2015-6-18 17:02
muzi.csu 发表于 2015-5-12 15:54
我买的是3KD的  15ml的超滤管。exo-free好像是将近2000元买的小规格

请问您是如何浓缩的呢？能不能分享一下？
作者: freeman811    时间: 2015-6-22 23:25
我是这样操作的：4℃, 3000g×15min,去除细胞及碎片；然后将上清移入Amicon-Ultra-15超滤管（Millipore公司），4℃，4000g×30min；吸取内网中200ul超滤液，再加入等体积exoquick提取液，混匀后放置过夜，离心后会有大量沉淀。
作者: yy8651    时间: 2015-6-23 09:53
freeman811 发表于 2015-6-22 23:25
我是这样操作的：4℃, 3000g×15min,去除细胞及碎片；然后将上清移入Amicon-Ultra-15超滤管（Millipore公司 ...

你的超滤管是多大的？100KD？
超滤30min不会把所有液体都滤掉吗？
你没有按照说明书的比例，而是按照1:1的比例加的提取试剂是吗？
谢谢
作者: freeman811    时间: 2015-6-24 23:22
yy8651 发表于 2015-6-23 09:53
你的超滤管是多大的？100KD？
超滤30min不会把所有液体都滤掉吗？
你没有按照说明书的比例，而是按照1:1 ...

超滤管是30KD，只要没有滤膜破损，超滤管具有残液保留功能，保证最终滤液的量在200ul左右，不会都滤掉。
超滤液是按照等比例加提取液，一是文献中也这么做；二是我也试过按照5：1加提取液，沉淀没有1：1的多，而且5：1去提取的exosome用Nono系统测量的粒径平均在500-600nm左右，且较为分散，感觉5：1不能完全提取。但1：1提取的我也没测过。供参考！
作者: 梦想照进现实    时间: 2015-7-13 09:08
宝莲 发表于 2015-4-23 19:18
我用life的试剂盒，20ml无血清的细胞培养上清提取也没有沉淀，做电镜可以看到少量外泌体。 ...

你好，最近准备用life的kit提取细胞培养上清，请问建议用多少上清呀？
作者: iiibuick    时间: 2015-9-9 08:52
我想请问一下，我也买的SBI的试剂盒，还没开始用，看了说明书有一些不是很清楚的地方，在最后加buffer那步是跟具体的后续操作有关系的，但说明书里主要就是针对RNA extraction 和protein extraction，我如果只是想要提取exosome，后面再标记蛋白，那是不是直接加PBS buffer就可以了？
作者: weaver    时间: 2015-10-30 19:33
iiibuick 发表于 2015-9-9 08:52
我想请问一下，我也买的SBI的试剂盒，还没开始用，看了说明书有一些不是很清楚的地方，在最后加buffer那步 ...

我想问问大家买的什么公司的SBI 试剂盒？哪家的比较好 能不能拍张说明书的图片呢？
作者: 子非鱼    时间: 2015-12-18 13:52
weaver 发表于 2015-10-30 19:33
我想问问大家买的什么公司的SBI 试剂盒？哪家的比较好 能不能拍张说明书的图片呢？ ...

我买的是吉泰生物科技有限公司的，你现在做的怎么样了，SBI试剂盒到底怎么样啊，真是森森的忐忑...
作者: 七七溪    时间: 2015-12-28 10:45
freeman811 发表于 2015-6-24 23:22
超滤管是30KD，只要没有滤膜破损，超滤管具有残液保留功能，保证最终滤液的量在200ul左右，不会都滤掉。
...

请问1:1这个kit用的是SBI的吗？
作者: ashey    时间: 2016-3-2 20:16
梦想照进现实 发表于 2015-7-13 09:08
你好，最近准备用life的kit提取细胞培养上清，请问建议用多少上清呀？

同问，细胞培养上清需要超滤浓缩吗？用了10ml培养上清也没有肉眼可见的沉淀啊。。。
作者: cherry    时间: 2016-3-17 13:18
加大到50ml 看看呢？一般看文献是间隔24小时收上清呢
作者: c1c2c3c45678    时间: 2016-3-23 19:54
Johnny 发表于 2015-1-24 19:11
你好，5ml的上清量太少。建议加大上清量。
另外，请问SBI公司的EXO-free的血清是从哪儿买的？ ...

请问
之前用SBI的kit最后一步1500g离心5min得到的沉淀基本上看不见，最近用3000g离心5分钟得到了肉眼可见的沉淀，还是不是外泌体？转速和时间是不是要严格按照protocol操作？
作者: grapetian    时间: 2016-6-28 22:33
我两个细胞系，各10ml培养上清，加2ml试剂,一个有明显的沉淀，一个没有看到沉淀
作者: 206895386    时间: 2016-8-29 11:51
我这边是用超速离心机离心血清后，去除外泌体，然后先是配成2%的去Exos的FBS培养基培养48h后，收集上清（约5ml的量）用SBI的试剂盒提exos，发现沉淀很少；后来又用20%去exos的FBS培养基培养24h后，收集上清（约2.5ml的量）用SBI的试剂盒提取exos，发现沉淀比之前的多。怀疑是不是超速离心机离心去除exos去除的不干净，有残留的。不知道用无血清的培养基培养细胞，然后收集上清提exos可不可以提出来？求高手指点。



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