外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 外泌体提RNA浓度很低，qPCR循环数35左右，曲线良好，但觉... [打印本页]
作者: cherry    时间: 2016-7-11 10:41
标题: 外泌体提RNA浓度很低，qPCR循环数35左右，曲线良好，但觉...
如题，像大家所反映的外泌体RNA浓度低，大概20~ 50ng/μL ，A260/A280 1.2~1.7左右，做过好几次，但每次qPCR 循环数都30以上，老师说量太少，A260/280低说明不纯，反转录cDNA量不一致，不能说明问题，大家有什么更好的解决方案么？最近尝试加大上清量试一试。欢迎交流~
作者: hzangs    时间: 2016-7-11 10:52
用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以不做参考，Qiagen的kit抽提的RNA 这个值也在1.6附近。
一般 GAPDH的CT值可以跑到20左右甚至更低
作者: grapetian    时间: 2016-7-11 19:31
hzangs 发表于 2016-7-11 10:52
用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以 ...

你好 我想问你们是用什么提rna?我想提细胞培养上清外泌体的rna用哪个试剂盒比较好？还是直接提exosome后加trizol提取？我看sbi和qiagen的都是提血清或血浆的外泌体rna
作者: hzangs    时间: 2016-7-11 20:36
grapetian 发表于 2016-7-11 19:31
你好 我想问你们是用什么提rna?我想提细胞培养上清外泌体的rna用哪个试剂盒比较好？还是直接提exosome后 ...

我用trizol  
作者: cherry    时间: 2016-7-13 11:09
grapetian 发表于 2016-7-11 19:31
你好 我想问你们是用什么提rna?我想提细胞培养上清外泌体的rna用哪个试剂盒比较好？还是直接提exosome后 ...

天根的比较好，101bio 提外泌体RNA 的产量是100μL 外泌体 RNA 产量50~100ng,远远不够，其他试剂盒我不知道，我觉得不需要试剂盒，天根比较彻底。
作者: cherry    时间: 2016-7-13 11:13
hzangs 发表于 2016-7-11 10:52
用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以 ...

恩，我这次上清液250ml试一下，还有我用的U6为内参，逆转录试剂盒是bio-rad 的，SYBR GREEN 是赛默飞的，这些性能好么？
作者: hzangs    时间: 2016-7-13 14:16
cherry 发表于 2016-7-13 11:13
恩，我这次上清液250ml试一下，还有我用的U6为内参，逆转录试剂盒是bio-rad 的，SYBR GREEN 是赛默飞的， ...

没有用过这些，不太了解。 应该还可以
作者: 完颜云裳    时间: 2016-8-10 23:36
楼主后面加大上清量结果有改善吗？我跑的结果也是这样，关键是U6也到了30几个循环了
作者: cherry    时间: 2016-8-12 17:58
完颜云裳 发表于 2016-8-10 23:36
楼主后面加大上清量结果有改善吗？我跑的结果也是这样，关键是U6也到了30几个循环了 ...

加大上清有改善，真的，因为我们样本量太小了，能养多少细胞别客气，尽量养，多收上清，他们上清用得比较少做出来是因为有一些是分泌型细胞，我的是一般肿瘤细胞，这次是100ml 收的U6 循环数22左右
作者: 完颜云裳    时间: 2016-8-16 23:19
感谢楼主的分享,我们做的是病人血清,一管500ul。这样一来结果就能解释了。
作者: wintersweet_d    时间: 2016-8-17 09:34
grapetian 发表于 2016-7-11 19:31
你好 我想问你们是用什么提rna?我想提细胞培养上清外泌体的rna用哪个试剂盒比较好？还是直接提exosome后 ...

Qiagen那个也可以提细胞系的外泌体，我提过
作者: konggy    时间: 2016-11-14 16:06
楼主能分享一下是用什么方法富集的外泌体吗。
作者: 烟尽云淡    时间: 2017-9-2 20:39
hzangs 发表于 2016-7-11 10:52
用10-20ul 水重悬， 浓度尽量保证在100ng/ul   
因为浓度低 所以260/280的值不是很正常，因此这个比值可以 ...

hzangs大神，看到您说用trizol提外泌体RNA效果还可以，想向您咨询请教一下。我是先用超离提外泌体，再用trizol提RNA，但RNA浓度一直很低，150ml细胞上清提外泌体，最后提取的rna用10ul 水溶解，用nanodrop测浓度在50ng/ul左右。很困惑，我的外泌体的提取也是按照经典的300g，10min；2000g，10min；10000g，30min；100000g，90min 两遍操作的，RNA的提取步骤大概如下：
1、向重悬得到的外泌体溶液（200ul）中加入1ml Trizol，反复吹打混匀，室温放置10min。
2、按比例加入氯仿200ul，剧烈涡旋振荡，4℃放置10min。
4、4℃ 12000g，离心15min。
5、小心吸取上层水相至新EP管（500ul-700ul）。
6、1：1加入异丙醇500ul-700ul，混匀，-20℃放置30min（想着低温、延长时间能增加rna富集）。
7、4℃ 12000g 离心10min，弃上清，RNA 沉于管底。
8、加入75%乙醇1ml，温和振荡。
9、4℃ 12000g 离心 5min，弃上清，晾干
10、加用10-20ul RNAse-free 水溶解沉淀RNA（室温），测浓度
麻烦啦
作者: urology_gxl    时间: 2017-12-19 23:17
外泌体miRNA 你们内参用U6吗？
作者: kundoctor    时间: 2018-1-26 04:00
烟尽云淡 发表于 2017-9-2 20:39
hzangs大神，看到您说用trizol提外泌体RNA效果还可以，想向您咨询请教一下。我是先用超离提外泌体，再用t ...

请问你得到的RNA  A260/280是多少？
我用肿瘤细胞上清液提，约400ml，过程一样，Takara的RNaiso plus 提, 最后得到RNA为浓度100ng左右，有时候达到150ng，但是A260/A280一直都 是1.5左右。
作者: 啊哈哈啊哈哈    时间: 2018-2-13 16:38
大神们，请问外泌体RNA的浓度能反应外泌体的浓度高低吗？
作者: yxy999    时间: 2024-3-16 15:49
完颜云裳 发表于 2016-8-16 23:19
感谢楼主的分享,我们做的是病人血清,一管500ul。这样一来结果就能解释了。

请问你们ct值大概多少呀



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