|
|
本帖最后由 seallin 于 2015-10-27 10:09 编辑
群里有很多人对试剂盒（SBI,Life etc）存在一点疑问，我做了快1年多的实验了，觉得还是应该站出来说几句。
首先陈述两个实验
1、通过试剂盒对照实验发现，空白血清（exo-free）并不能提取到沉淀，而培养过细胞的血清则能提取到沉淀，说明提取到的不是蛋白聚集体，不然空白血清中那么高的蛋白含量也应该有沉淀才对。
2、血清经过10000g离心，又经过0.22 um滤膜过滤，用试剂盒提取后，能提取到沉淀（由上文证明不是蛋白聚集体），因此沉淀应该不可能是细胞碎片，故应该就是exo
写到这里，我想大家应该也认为试剂盒提取到应该是exo
但是大家为什么会对试剂盒有疑问呢？无非是三个问题，1、很难重溶；2、TEM不好做；3、WB不好做；4、沉淀量远远超过超速离心
下面我来解释一下，
1、并非不好重溶，加入水用枪头一吹打，立马就溶了，如果觉得不好重溶的一定是你方法不对；
2、由于有聚合物，TEM确实非常难做（这是试剂盒的一大缺点），我曾经做了3天的HRTEM（200 kv）才做出来；
3、WB不好做不是提取的问题，是提取的不够纯。为什么不够纯，下面重点介绍：高速离心的时候，我们第二遍会用PBS再离一遍以除去血清蛋白，而试剂盒的protocol里没有清洗这一步，这导致提取的exo中含很多血清蛋白。做实验小心一点，尽量去除管壁上的残留，实在不行，重溶后再提一遍，效果会很好；
4、如果用24h超离的血清培养细胞后，再用试剂盒，沉淀量会非常小，因此，我认为可能是血清没有离心干净的原因。
最后补充两句，
1、方法有好坏，技能有高低，如果实验做的熟练了，尽量避免可能出现的问题，还是可以做出很好的结果的。祝大家实验顺利！
2、如果是后续的分析和检测，两种方法都行，当然试剂盒更加方便。如果是用到exo做其他实验，比如尾部注射，还是安心用超离吧
Lobb RJ Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma, J Extra Vesc, 2015的这篇文献是有问题的，因为的对照组，沉淀得到的样品根本就没有洗干净，所以做出来的结果当然不好。用一个不正确的方法进行对比，结果可想而知。
最后很感谢与Hzangs的交流，提出了一些关键的问题，我会就一些问题进行近一步的考察。
如果还有疑问，欢迎留言
|
|
/1 
|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles
发表于 2015-10-26 13:59:55
收藏
楼主