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楼主: 宋梦阳
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PKH67染色

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发表于 2015-12-17 08:49:37 | 显示全部楼层
wanghx_85 发表于 2015-12-16 22:54
跪谢惜名版主,非常感谢。

不用谢
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发表于 2015-12-18 08:44:49 | 显示全部楼层
wanghx_85 发表于 2015-12-18 00:00
呼叫惜名版主,那个外泌体染色、重提、PBS重悬后,一般加多少ul至靶细胞中共培养呢?假设24孔板做的话, ...

这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板,一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是,也要根据你获得exo的量的,如果获得的exo很少,你用200ul重悬,那或许浓度就太低了。。。
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发表于 2015-12-19 09:28:24 | 显示全部楼层
wanghx_85 发表于 2015-12-18 23:52
惜名版主,根据您的指导,我写了个大概的染色步骤,请您再帮忙指导下看我的理解是否正确:
1、SBI提取外 ...

对的,是这样的步骤。
根据SBI官方的说明,如果你能把最终的体积控制在0.5ml,然后加入0.1ml的ExoQuick,只需要冰上静置0.5小时,然后12000rpm*4min离心,就可以获得exosome了。
在实际操作中,我会尽量把最终的总量控制在0.6ml,然后加入1/5体积的ExoQuick,4度静置40-60min,然后12000rpm*4min离心。

嗯,理论上最好避光,因为PKH67是荧光染料。但是操作过程其实非常短。只需要十几分钟,所以我都没避光。4度静置的时候是避光的。
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发表于 2015-12-20 09:40:25 | 显示全部楼层
wanghx_85 发表于 2015-12-19 22:31
最终总量控制在0.5ML?有难度呀,版主,你看PBS重悬的EXO有100ul,按您说的降低试剂比例来的话,稀释液C  ...


我都是直接把0.4ul PKH67加入“PBS-EXO-稀释液”的~
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发表于 2016-1-15 08:48:36 | 显示全部楼层
wanghx_85 发表于 2016-1-14 12:07
惜名版主,做了几次失败了,哎,现在都好烦躁,觉得这个外泌体太难做了,为啥我连外泌体都染不上呢?我染 ...

失败了是啥意思?具体讲讲在哪一步出了问题?
我前天又染了一次,很成功啊,步骤不复杂,也不需要完全25度,室温就可以了。
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发表于 2016-1-21 16:35:22 | 显示全部楼层
wanghx_85 发表于 2016-1-21 12:10
再补充下,外泌体提取试剂盒是SBI的,PKH67是Sigma的,BSA比较屌丝,是碧云天花10块钱买的,请版主帮我分 ...

你染后用SBI重提离心结束能看到黄色沉淀么?如果能,那说明染色没问题的,如果不能,那就悲剧了。
如果染色没问题,摄取实验看不到绿光,还有可能是细胞没摄取啊。。。
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发表于 2016-1-24 12:49:16 | 显示全部楼层
wanghx_85 发表于 2016-1-22 21:46
沉淀是什么颜色的我还没注意呢,下周再做再看,版主,您用的是什么孔板做摄取实验(12孔还是6孔?)?每 ...

我6孔12孔都做过。每孔细胞正常就行啦,或者稍微稀一点。加入exo后培养24小时就应该能看到很明显的摄取了~
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发表于 2016-10-18 17:23:46 | 显示全部楼层
yuantingdong 发表于 2016-10-17 14:41
惜名兄,我查看SBI说明书,步骤跟你说的不一样,为何你的是4度静置40-60min,然后12000*4min离心。谢谢。
...

静置40-60min是因为我浓缩以后,体积很小了,只要半个多小时就可以。如果你是10ml的体积,还是要过夜的
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发表于 2016-10-22 20:38:31 | 显示全部楼层
小七果果8 发表于 2016-10-22 16:09
请问惜名前辈,荧光标记,BSA终止标记后需要加多少PBS,然后再用EXOquick啊?老害怕提两次,会有很多杂质 ...

不用加PBS了啊。。。我直接加exoquick然后静置、离心的。。。但是,有时看不到沉淀,感觉不是很稳定~
多余的荧光染料估计很难避免,所以如果能用超离是最好的。试剂盒总是存在各种污染的问题
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