PKH67染色

惜名

wanghx_85 发表于 2015-12-16 22:54
跪谢惜名版主，非常感谢。

不用谢

惜名

wanghx_85 发表于 2015-12-18 00:00
呼叫惜名版主，那个外泌体染色、重提、PBS重悬后，一般加多少ul至靶细胞中共培养呢？假设24孔板做的话， ...

这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板，一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是，也要根据你获得exo的量的，如果获得的exo很少，你用200ul重悬，那或许浓度就太低了。。。

惜名

wanghx_85 发表于 2015-12-18 23:52
惜名版主，根据您的指导，我写了个大概的染色步骤，请您再帮忙指导下看我的理解是否正确：
1、SBI提取外 ...

对的，是这样的步骤。
根据SBI官方的说明，如果你能把最终的体积控制在0.5ml，然后加入0.1ml的ExoQuick，只需要冰上静置0.5小时，然后12000rpm*4min离心，就可以获得exosome了。
在实际操作中，我会尽量把最终的总量控制在0.6ml，然后加入1/5体积的ExoQuick，4度静置40-60min，然后12000rpm*4min离心。

嗯，理论上最好避光，因为PKH67是荧光染料。但是操作过程其实非常短。只需要十几分钟，所以我都没避光。4度静置的时候是避光的。

惜名

wanghx_85 发表于 2015-12-19 22:31
最终总量控制在0.5ML？有难度呀，版主，你看PBS重悬的EXO有100ul，按您说的降低试剂比例来的话，稀释液C  ...

我都是直接把0.4ul PKH67加入“PBS-EXO-稀释液”的~

惜名

wanghx_85 发表于 2016-1-14 12:07
惜名版主，做了几次失败了，哎，现在都好烦躁，觉得这个外泌体太难做了，为啥我连外泌体都染不上呢？我染 ...

失败了是啥意思？具体讲讲在哪一步出了问题？
我前天又染了一次，很成功啊，步骤不复杂，也不需要完全25度，室温就可以了。

惜名

wanghx_85 发表于 2016-1-21 12:10
再补充下，外泌体提取试剂盒是SBI的，PKH67是Sigma的，BSA比较屌丝，是碧云天花10块钱买的，请版主帮我分 ...

你染后用SBI重提离心结束能看到黄色沉淀么？如果能，那说明染色没问题的，如果不能，那就悲剧了。
如果染色没问题，摄取实验看不到绿光，还有可能是细胞没摄取啊。。。

惜名

wanghx_85 发表于 2016-1-22 21:46
沉淀是什么颜色的我还没注意呢，下周再做再看，版主，您用的是什么孔板做摄取实验（12孔还是6孔？）？每 ...

我6孔12孔都做过。每孔细胞正常就行啦，或者稍微稀一点。加入exo后培养24小时就应该能看到很明显的摄取了~

惜名

yuantingdong 发表于 2016-10-17 14:41
惜名兄，我查看SBI说明书，步骤跟你说的不一样，为何你的是4度静置40-60min,然后12000*4min离心。谢谢。
...

静置40-60min是因为我浓缩以后，体积很小了，只要半个多小时就可以。如果你是10ml的体积，还是要过夜的

惜名

小七果果8 发表于 2016-10-22 16:09
请问惜名前辈，荧光标记，BSA终止标记后需要加多少PBS，然后再用EXOquick啊？老害怕提两次，会有很多杂质 ...

不用加PBS了啊。。。我直接加exoquick然后静置、离心的。。。但是，有时看不到沉淀，感觉不是很稳定~
多余的荧光染料估计很难避免，所以如果能用超离是最好的。试剂盒总是存在各种污染的问题