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angma

初入外泌体，常在文献中看到用多少浓度的外泌体treat， 或者收获后测得外泌体浓度是多少，想问下这个浓度是怎么测得的呢？怎么知道我的样本离心或者使用kit提取之后的外泌体浓度是多少。搜索了半天总是找不到关键的答案，希望能得到您的解答，谢谢！

hzangs

pfdsj 发表于 2018-7-18 17:42
您在初识外泌五，有提到抽提外泌体用TAKARA的9094，我也用了，之前咨询过技术，他们回复得到水相之后按照说 ...

说明书里是沉淀DNA的。 咱们是要抽提RNA，能一样么亲    请按照我的方法来！

pfdsj

您在初识外泌五，有提到抽提外泌体用TAKARA的9094，我也用了，之前咨询过技术，他们回复得到水相之后按照说明书加无水乙醇沉淀RNA, 您在文章中提到是在水相中加两个添加剂之后，按通常的做法加异丙醇沉淀，不按说明书而是加异丙醇的效果会更好？

hzangs

Megan 发表于 2018-7-17 15:15
大神，想请问下外泌体提取microRNA的具体protocol，后期荧光定量PCR用什么内参比较好操作啊 ...

论坛和公众号里很多。自己找。 不再赘述

Megan

大神，想请问下外泌体提取microRNA的具体protocol，后期荧光定量PCR用什么内参比较好操作啊

hzangs

yazisummer 发表于 2018-7-11 10:29
hzangs大神!
我用原代培养的细胞，无FBS培养基饥饿48小时后，收取上清，4度存放了两天。20，000g 4度离心20 ...

强调好多遍了……    这种问题我真不想再回答了…… 最后一次……

原代细胞本来分泌量就低，所以起始培养细胞量要大，起始体积至少要按百毫升算，100没有就200。   超离结束 上清不要倒， 吸走，底部留一点培液。  最好用水平转，不要用角转。  看不到沉淀没关系，只要检测有蛋白浓度  跑wb有条带  电镜有结构  NTA符合就行了。

yazisummer

hzangs大神!
我用原代培养的细胞，无FBS培养基饥饿48小时后，收取上清，4度存放了两天。20，000g 4度离心20min,    10,000g 4度离心30min后，100，000g 4度离心2h后未有可见沉淀。 去上清加PBS后100，000g 4度离心1h未见可见沉淀。
加150ulpbs冲洗管底和壁，直接去此溶液未裂解BCA测浓度。浓度跟空白一样。
谢谢hzangs大神指教，看看我的问题出在哪里？

hzangs

yunyu 发表于 2018-7-10 09:16
hzangs老师，我们在做5%，10%，20%，40%的OptiPrep梯度，离心100000*18h，但做出来杂ALIX带很弥散，在每层 ...

没有试过optiprep，  不建议以wb的结果来评判实验的成败。 ALIX这种蛋白只是在外泌体里富集，并非只存在于外泌体中。 以电镜结果为准~~

hzangs

lictic 发表于 2018-7-9 21:49
请问是否每次提外泌体都需要测浓度？同种细胞系每次提取的外泌体蛋白量变化大吗？能否通过毫升数、皿数进行 ...

每次测浓度。

yunyu

hzangs老师，我们在做5%，10%，20%，40%的OptiPrep梯度，离心100000*18h，但做出来杂ALIX带很弥散，在每层里都有。想问一下做OptiPrep梯度是要跟蔗糖梯度一样做好之后过夜等蔗糖自由扩散么?还是有啥其他问题