关于SBI试剂提取Exo, 如何浓缩细胞上清

medjinjuan

看坛子里不少同学提到用kit提取exo之前，可以用超滤管浓缩一下，那想请教做过的同学几个问题哈1.使用100kd的管子吗，多少转离心多久，这个有protocol吗？
2.一般是用10ml的培养基，可以浓缩到多少啊？
求指导！！！！

zjm337

惜名 发表于 2016-12-24 20:21
1、不会
2、不知道
3、看细胞分泌能力，我养DC，分泌很厉害

好的，谢谢

惜名

1、是用100kd的管子，买的时候，会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min，但实际操作的时候可以自己调整，我一般是先用3000rpm转5min，拿出来看看浓缩了多少，然后再酌情考虑是否再离心一次。
2、我个人经验，10ml的培养基可以浓缩到1-2ml。但是，私下里认为，浓缩以后再用SBI试剂盒，杂质可能会更多。因为我用过浓缩和非浓缩的方法，感觉前者提取的“沉淀”明显增加了。

后来，我对SBI的protocol做了改良：先是1500rpm*30min，然后13000rpm*20min(这个转速是参考RIPA提取蛋白的，目的是进一步去除大分子和细胞碎片，选择13000rpm是因为，普通的离心机只能达到这个速度了)，然后再过0.22um的滤器，进一步去除大颗粒。

然后再用100kd的管子浓缩，这样纯度会增加不少~
即使不用管子浓缩，这样的步骤也有利于增加纯度。

供参考~

medjinjuan

惜名 发表于 2016-10-7 09:17
1、是用100kd的管子，买的时候，会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min，但实际操作的时候可以自己 ...

非常感谢，能有这样的交流，

medjinjuan

惜名 发表于 2016-10-7 09:17
1、是用100kd的管子，买的时候，会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min，但实际操作的时候可以自己 ...

请问，你用SBI提取的exo打过电镜吗？是不是kit提取的很难出好看的图啊，

medjinjuan

惜名 发表于 2016-10-7 09:17
1、是用100kd的管子，买的时候，会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min，但实际操作的时候可以自己 ...

请问，你用SBI提取的exo打过电镜吗？是不是kit提取的很难出好看的图啊。

惜名

medjinjuan 发表于 2016-10-7 10:54
请问，你用SBI提取的exo打过电镜吗？是不是kit提取的很难出好看的图啊。

打过，嗯，杂质比较多，做了几次，才勉强满意。到了审稿人手里，也argue了一番，反正最后通过了，哈哈

dancing

我用的15ml的100KD的超滤管是4000转大约是2000多g离心了20分钟离心到250μl左右，因为细胞房里的离心机比较小，要是用3000g离心时间可能可以缩短

medjinjuan

惜名 发表于 2016-10-7 09:17
1、是用100kd的管子，买的时候，会给说明书的。我记得说明书建议是3000rpm*5min，但实际操作的时候可以自己 ...

大神大神，我看你写的改良的方法是最后再用100KD的超滤管子浓缩，而不是最开始就用，是我理解有误解了吗？

惜名

medjinjuan 发表于 2016-10-13 13:30
大神大神，我看你写的改良的方法是最后再用100KD的超滤管子浓缩，而不是最开始就用，是我理解有误解了吗 ...

嗯，最后再用啊~前面你先用各种方法把能去掉的杂质都去掉，然后再浓缩，应该会使浓缩液不那么粘稠吧，个人感觉。。。如果一开始就浓缩，那么多杂质混在最后的浓缩液里，后面处理如果充分的话，应该也行~~

medjinjuan

惜名 发表于 2016-10-13 18:28
嗯，最后再用啊~前面你先用各种方法把能去掉的杂质都去掉，然后再浓缩，应该会使浓缩液不那么粘稠吧，个 ...

好的，谢谢大神啦·