|
写在前面：新一版的MISEV已于近日online。Hzangs这里略作介绍，让大家了解一下。考虑到发布方是一个协会团体，其指导意见并没有强制性，如果在大家阅读和实验设计时遇到认为值得商榷的地方，可以考虑按照自己的想法来，毕竟不是每一个人都有thery那样的精力去深究细胞外囊泡的方法学。如果大家都像thery那么干，囊泡领域就没办法做了。另一方面，由于未来大家投稿的时候可能审稿人就是协会内的成员，审稿人可能会那这一《指导要求》来质疑你的结果，所以大家还是提前考虑好如何应对。通常来说，投的文章越高，越容易被问及实验设计严谨性的问题；大家可以根据自己追求的文章高度来选择性的遵从《指导要求》内的一些条目。 细胞外囊泡研究近些年方兴未艾，基金资助数量及关注这一领域的学者数量依旧在快速增长。越来越多的研究人员开始关注细胞外囊泡在自己领域内可能的功能机制和应用。但是由于目前的实验手段限制，我们对细胞外囊泡这类纳米级别的非细胞结构的操作还存在一定的技术困难，如何保证实验的严谨性和可重复性依旧是领域内可能影响整个领域发展的重大问题。
基于这一点，为了使细胞外囊泡领域的研究更加严谨，提升不同实验室的实验结果的可重复性，由欧洲多国细胞外囊泡领域的学者发起并成立的国际细胞外囊泡协会于2014年在协会会刊Journal of Extracellular Vesicles发表了一个指导性意见，也就是我们常说的MISEV2014。这一版本的《指导要求》中介绍了细胞外囊泡研究必要的实验规划，以及细胞外囊泡研究中应当注意的操作要点。主要从“证明样品中存在细胞外囊泡的最低实验要求”“细胞外囊泡的一般特性”“细胞外囊泡功能研究：建议设置合理对照组”等方面对细胞外囊泡的研究提出了一些强制性的要求。这一《指导要求》很好的规范了细胞外囊泡研究方法并且一定程度上使新进入该领域的朋友快速了解和掌握细胞外囊泡研究的实验规划方法和相关实验技术。但是细胞外囊泡领域经过四年的飞速发展，旧版本的《指导要求》中的一些表述和建议已经逐渐不适用于目前的研究，旧《指导要求》中部分要求明显落后于目前领域内研究的需求，这就造成依据旧版本《指导要求》进行试验依旧可能得出错误结论。
基于这些进展，以细胞外囊泡研究方法学领域内的重要学者thery为主的相关研究人员对MISEV2014进行重新修订和升级，因此产生了新版本的《指导要求》 MISEV2018。 新版本的《指导要求》于近日上线。相比过去只有6页的指南，这次的指南足足有47页，作者信息占了10页，参考文献占了13页，单单一个checklist还占了2页。这次的指南真的是事无巨细了，而且每一个段落和声明都有从ISEV会员那里来的调查数据来说明支持相关表述的会员所占百分比。hzangs这次没办法短时间内给大家详解《指导要求》了，后期会分成多次解析《指导要求》，这次仅做一些要点的提示。希望能对大家有所帮助。（hzangs注：另外在《指导要求》作者名单中没有看到David Lyden的名字，目测Lyden还是没有融入这个欧洲人为主的圈子吧，但是Lyden作为领域内举足轻重的学者，他的意见其实也应该被尊重。Hzangs再注：这篇《指导要求》特意提到了Lyden关于囊泡亚群exosomer的文章部分结果无法重复的问题，让我们持续关注一下。） 最重要的一点，很多朋友说由于自己的样品珍贵，如果拿去做各种鉴定实验最后就剩不下什么样品用于功能研究了。针对这一点，《指导要求》也进行了说明，如果样品珍贵且分离的细胞外囊泡很少，无法用于过多的鉴定和验证实验，可以在写文章的时候声明并解释由于什么原因造成无法完成《指南要求》里的最低标准。
这次的《指导要求》首先讨论了对这些细胞来源的非细胞具膜结构如何称呼。在“Nomenclature”板块学者们普遍认为应当使用细胞外囊泡（extracellular vesicle）来称呼这些具膜囊泡，当我们使用常规方法分离这些结构时不推荐使用其他的名称来称呼它们。外泌体（exosome）仅适用于通过特殊手段拿到的由胞内体来源的释放到细胞外的膜泡结构。建议对细胞外囊泡进行细分时使用物理上的界定如小细胞外囊泡（sEV）和中/大细胞外囊泡（m/lEV），或者高密度囊泡（high density）和低密度囊泡（low density）等，同时也建议使用表面蛋白来界定如CD63+CD81+细胞外囊泡等。当使用exosomes等称呼是应当进行严谨的实验证明使用的“exosomes样品”是有胞内体途径产生的。
《指导要求》在“Collection and pre-processing: pre-analytical variables”中还指出，针对细胞上清条件培养液来源细胞外囊泡进行研究时应当注意每次保留收获条件培养液时细胞的凋亡百分比。这是基于这几年的研究报道，研究发现小部分的凋亡细胞即可以释放出大量的囊泡，其比例甚至超过我们真正想要的到的细胞外囊泡比例。同时对条件培养基的收获进行了一定的约束和要求。另外针对目前细胞培养液中添加含有细胞外囊泡成分的组分影响细胞外囊泡的收获也做了相应的规定。《指导要求》要求在使用含有囊泡组分的培养液时设置一个未经任何处理的培液组作为阴性对。，《指导要求》给出的去除血清中细胞外囊泡的条件是血清与培养液至少按照1:4的比例稀释后使用10万g的离心力处理18h。或者通过超滤处理去除囊泡组分。针对商品化的“无囊泡血清”也给出了建议，《指导要求》认为目前商品化的“无囊泡血清”并没有技术指标也没有公布相应的去除方法，因此要求在使用前对商品化的“无囊泡血清”要进行慎重和严谨的论证。针对样品储存，目前依旧没有给出合适的方案。目前《指导要求》只要求在发文章时详细注明培液或体液曾经的储存条件以及细胞外囊泡样品的储存条件。换句话说，大家按照自己的想法来，只要不影响自己的实验结论即可。 《指导要求》还通过与MISEV2014版进行对比。说明了目前MISEV2018版的完善情况。 关于分离方法。2018版的《指导要求》依旧说明目前没有单一的分离手段，多种手段都可以进行细胞外囊泡的富集。但是相比2014版的《指导要求》，新版《指导要求》对目前常见的分离手段进行了分类点评。《指导要求》编写者们认为“高回收率，低特异性”的富集手段是指那些富集囊泡的同时会有大量的非囊泡组分被富集，甚至细胞的整个分泌组都会被掺入其中，归入这一类的分离手段主要包括通过改变电荷或通过高聚物作用的沉淀试剂盒、低分子量截流的超滤分离、超长时间和超高离心力的超速离心等。“适中回收率，适中特异性”的富集手段是指富集囊泡的同时会富集到部分游离蛋白和核酸的方法，归入这一类的分离手段主要包括凝胶排阻层析、高分子量截流的超滤、我们经常用的差速离心、切向流过滤、亲和层析等。“低回收率，高特异性”的富集手段是指可以富集到一定的囊泡亚群（如sEV）同时仅带有少量的其他非囊泡成分，归入这一类的方法包括结合凝胶排阻层析的超滤分离、密度梯度分离、结合其他手段的免疫沉淀等“高回收率，搞特异性”的方法主要是指富集不同囊泡亚群的同时还可以有很高的回收率，这一类的方法主要包括“目前不存在未来可能有的方法”（hzangs注：这是文章里的原话！）。 总结一下，PEG沉淀的方法可以用，但是纯度很低，想发高分文章就做好被reviewer问的准备。前几年协会青睐的凝胶排阻层析经过这几年的研究应用发现其实纯度一般，跟差速离心一个水平。想拿纯度高的囊泡请直接使用最复杂的手段，简单好用又纯度高的分离手段现在不存在。市面上的试剂盒大家理性对待。
关于定量方法。2014版的《指导要求》没有对定量方法给出明确的指导。新版《指导要求》给予了一些建议，《指导要求》要求记录分离细胞外囊泡是条件培养液的体积及对应细胞量，体液应当记录相应的体积。《指导要求》指出总蛋白定量会受到游离蛋白影响、总脂质定量会受到脂蛋白等脂质成分影响、特定表面标志物在富集的囊泡样本中只能反映该标志物阳性的囊泡群体而忽略其他囊泡、粒子数定量会受到粒子粘连和非囊泡粒子的影响。因此要求大家同时使用两种以上的方法进行定量并给出每一个囊泡样本两种定量方法的比值。例如你使用总脂质定量和总蛋白定量，那就要每个样本都包涵一个总脂质量：总蛋白量的值。Hzangs认为这个方法还不错，这样定量可以保证样本的纯度均一性，如果比值在不同的样本中不一样，那就说明囊泡样品制备有问题，不同样品中囊泡量和纯度不同，那也就没办法继续下一步试验了。同时这一比值与其他不同的文章报道进行横向对比也可以知道你样品的纯度。
关于细胞外囊泡蛋白鉴定。两版内容主旨变化不大，但是MISEV2018对很多内容进行了更为细致的划分。WB鉴定细胞外囊泡蛋白至少需要检测膜蛋白（如CD63、CD81、CD82、HLA、integrin等），检测膜结合蛋白或外泌体游离蛋白（前者如ALIX、TSG101，后者如HSP70、ACT等）。同时规定了不同种类样本应该酌情考虑的阴性对照，阴性对照的目的主要用于反应富集的细胞外囊泡样品的纯度。另外还考虑了研究细胞外囊泡特定亚群是需要设置的一些阴性对照，这里不再赘述。Hzangs认为大家不必太在意，这块的变化不大，唯一更多的要求是在阴性对照的设置上。
关于单个细胞外囊泡的群体表征。与之前版本相似，要求通过至少两种手段来分析细胞外囊泡，例如通过可视化的如电镜、原子力显微镜、超高分辨率显微镜等的单个囊泡结构观察以及通过NTA、RPS、纳米流式等。《指导要求》指出目前没有仪器可以轻易分析样品中所有不同粒径的囊泡群体情况。纳米流式细胞去分析细胞外囊泡的具体细节正在经由不同的协会协商制定可行的指导方案。NTA通常无法关注小于50nm和大于400nm的粒子，RPS的检测性质决定了其对定量的不准确性（如蛋白颗粒、蛋白复合体、脂蛋白颗粒等通过电阻孔也会被记做囊泡），DLS方法更为适合均一例子的检测和分析。目前使用DLS方法和RPS方法进行粒子定量并不准确，通常计算结果会偏高。
关于特定蛋白与细胞外囊泡的拓扑关系。在2014版的《指导要求》并没有提供这方面的建议。新版本的《指导要求》增加了这方面的内容。《指导要求》指出，在研究一些与细胞外囊泡相关蛋白和核酸时有必要通过实验来证明其与细胞外囊泡的关系即：在囊泡内部、结合于表面还是仅仅由于纯化方法问题造成细胞外囊泡与其共同被富集。 针对如何通过WB来验证标志蛋白在细胞外囊泡样品中的富集，《指导要求》也做出了相应的解释——通过细胞裂解液和细胞外囊泡样品并排同时跑WB分析标志蛋白来看细胞外囊泡样品组标志蛋白的条带是否明显比细胞组更亮。可以根据某特定蛋白的量来进行上样也可以根据特定细胞数分泌的囊泡量上样（hzangs注：例如根据GAPDH来计算，细胞裂解液和囊泡中GAPDH的条带亮度一致或者通过定量计算得到1亿个囊泡由1万个细胞释放然后上样1万个细胞的裂解液和1亿个囊泡裂解液）。
最后一点，关于验证你所关心的功能（如对心肌损伤的修复、肿瘤迁移的增强等）是细胞外囊泡在发挥作用还是由于分离手段的限制造成与细胞外囊泡共同分离的物质在发挥作用。《指导要求》给出了一些验证方法。例如通过纯度更好的分离方法来得到更纯的囊泡用于下游功能验证、利用洗涤剂等破掉细胞外囊泡的结构再用于下游功能验证。同时《指导要求》对如何验证特定亚群的细胞外囊泡功能给出了一些建议。 概述就到这里。这次MISEV的更新使我们有了一个更为完善的实验指导，但是也存在一些问题和潜在的风险。科学研究本是科学共同体的事情，科研方法需要经过广大的学者经历广泛的验证最终得出大家认可的操作策略，这样通过一个协会发布一版《指导要求》对于一个领域的发展是好是坏还很难说。既然是一个团体发布的《指导要求》，那就会或多或少的照顾团体内成员的利益，这一《指导要求》是否公正无私还需要广大学者的评判。由于其协会性质，协会内有大量的会员处于这一研究领域之中，如果协会成员在作为审稿人和基金审批专家对稿件进行评审和项目申请进行审批时利用这一《指导要求》来规范大家的实验还好，但是如果以《指导要求》为名要求大家添加引用文献、使用特定的方法或者产品来进行实验那就会出问题了。已经听说这一指南的主要起草人在呼吁团体内成员在审稿和审标书的时候要求其他人遵从指南的要求了。科学本事一个不断交流和争辩的领域，这样树标杆搞权威独占话语权有点让人无法接受。另外，考虑到团体内部也只有几个人牵头在编写这一《指导要求》，个人的利益和偏好是否在这之中得到了体现也是值得商榷的，毕竟单个人员的知识范围有限，但是细胞外囊泡研究相关仪器及试剂原理所涉及的领域又比较广，这就可能因为个人利益和偏好对《指导要求》的中立性和指导意义带来一定的影响。当然，这里也仅仅是表达一下hzangs个人的担忧，相信国际囊泡协会现在的团体成员还是会秉公无私的为大家服务的。考虑到《指导要求》给出了非常详细的实验规划设计原理，相信这份指南对于大家来讲还是利远远大于弊的。非常建议大家详细阅读和了解。这样在未来投稿和申请基金的时候都相对比较稳妥。 原文会放到外泌体之家对应的同名贴下，感兴趣的朋友可以下载阅读。
| 
[复制链接]
/1 
|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles
发表于 2018-11-28 18:53:09
收藏
发表于 2018-11-28 19:39:59
